循环miRNA检测方法研究进展及其临床应用.pdfVIP

108 士 · 综述 · 循环miRNA检测方法研究进展及其临床应用 赵莹莹 邢卉春 miCroRNA (miRNA)是一种保 守的、非编 及逆转录PCR的优点，可以精确测量和鉴别特异性核 码 的小RNA，长度约为22个核苷酸 。首次发现于 酸，误差小，而且具有灵敏度和特异性高、可重复性、 Caenorhabditisy线虫体内，现有的技术已发现1000多 高 自动化、无污染、实时和准确等特点。 ~OmicroRNA。miRNA存在于低级生物、植物、高等动 2．Northern blot方法及其改进方法：Northernblot 物等多种生物中，在正常与疾病状态下，参与调节免 方法在定量检~)M,OmiRNA中发挥着重要作用，其优点是 疫、细胞周期、生物代谢和凋亡等多个生物过程 1『。]。 可 以鉴定miRNA的分子量大小，可以同时显示多个 多数 (保守进化的)miRNA由RNA聚合酶 II指导转 miRNA的分子量大小及浓度 ；传统的Northernblot杂 录，通过miRNA特定的seed序列 (5-末端2～8个核苷 交包括通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide 酸)及其互补序列碱基来识别靶mRNA3一非翻译区 gelelectrophoresis，PAGE)分离到小RNA片段；将 (3untranslatedregion，3．UTR)末端的位点 j，从 分离的RNA转到尼龙膜 ；用带有 P标记的探针与 而阻断翻译，使靶mRNA降解，或负性调控靶基因的 之杂交、并检测 目的片段。但Northernblot也有其局 表达，减弱蛋 白翻译，发挥靶mRNA的转录后调控作 限性，操作过程复杂、耗费时间长，增加了目的片段 用 ，因此，在生命过程中，某些miRNA表达的缺失 被RNA酶降解的风险；同时miRNA不易结合于固相 或过度表达，会引起某些系统组织及细胞分化代谢及 杂交膜上，因此会浪费大量RNA标本，敏感性很低， 凋亡等异常 J。有些miRNA仅表达于特定组织、器官 经常会导致检测低丰度的miRNA时无结果。此外， 或高表达于某些组织、器官，称为组织、器官特异性 这种类型的杂交，是基于放射性探针和甲醛的，对人 miRNA，例如miRNA一122是肝脏组织特异性miRNA。 和环境都存在着很大的安全隐患。Wang等”对传统 近年来发现miRNA不仅存在于某些组织，而且还存在 Northemblot进行改进，形成液XHNorthemblot杂交， 于细胞外液体。大量研究表明循环miRNA (血浆或血 该方法检测miRNA简便、快捷、准确、费用少；如果 清miRNA)在疾病诊断中的也具有 一‘定参考价值。本 用多种荧光探针的话，可以同时检测多@miRNA。 文就循环miRNA在疾病诊断中的应用进行综述。 与传统的Northernblot杂交不同，液X[~Northemblot选 一 、 miRNA的检测及分析方法 用荧光素FITC或Cy3作为标记探针的标记物，避免产 1．荧光实时逆转录 定量 PCR (real—timereverse 生放射性物质；在杂交过程中，不使用尼龙膜，使用 transcriptionquantitativePCR，RT-qPCR)：该方法是 磷酸钠缓冲液 (30mmol／L，pH=8．0)、NaC1溶液 定量检测miRNA的金标准，可以对miRNA进行相对 (0_3mmol／L)~HEDTA (10mmol／L)混合而成的杂 定量和绝对定量检测 ，可较直观地检测miRNA的 交缓冲液；然后杂交后的样本进行非变性10％TBE一 表达水平。利用阳性梯度标准品的ct值制成标准曲线， 聚丙烯酰胺凝胶或10％TAE一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (90 在得到样本的ct值后，可在标准 曲线上根据直线 回 V，电泳40min)；最后用QuantityOne软件根据荧光 归计算出待测样本的初始拷贝数。与传统的PCR方法 图像对miRNA进行定量分析 。该方法可以检测到普 相比，简便、省时，扩增后不需使用凝胶电泳、DNA 通Northernblot杂交无法检测到的miRNA，并且可以 测序和Southernblot等方法，而是直