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依赖于NADPH酮基还原酶的克隆表达 李平作，葛佳佳，朴文花，魏诚哲，汤祺麟，胡学智 中国科学院上海生物工程研究中心200233021 pzli@srcb．ac．crl 据FDA调查，手性药物可形成上千亿美元的高技术产业，已上市和在开发的 新药中有超过50％的药物是以手性药物的形式上市。在1994年，有一批手性药物 市场增长大于50％，如Merck的治疗高血压的ACE抑制剂赖诺普利和治疗良性前 列腺增生的5Q．还原酶抑制剂非那甾胺；Pfizer的舍曲林和SKB的帕罗西汀；大正 制药的甲红霉素：BMS的紫杉醇等。 市场需求的高速增长，刺激了手性药物的研究与开发，而手性化合物的生物 合成，是手性药物生产取得突破的关键技术。生物合成是利用酶促反应或微生物 成单一光学活性产物。优点为反应条件温和(通常在20℃--一30C)，位点选择性强， 并能完成一些化学反应难以进行的反应，副反应少，收率高，光学纯度高(100％对 映体过剩)，无环境污染。 利用生物技术引入手性主要经历了三个发展阶段。早期是对外消旋底物进行不 对称水解拆分制备手性化合物。这种方法主要是利用一些水解酶类，其缺点是必 需先合成外消旋目标产物，拆分的最高收率不超过50％，需将另一对映体消旋化， 经过循环最终转化成目标产物。随后是利用微生物的直接转化，这种方法的优点 是产物的光学纯度大为提高，但受酶表达量和投料浓度的限制，生产过程中底物 的投料浓度难以大幅度提高，影响了目标产物的产量。最近的发展是引入基因工 程技术，利用工程微生物或酶直接转化，或利用氧化还原酶、合成酶、裂解酶、 水解酶、羟化酶、环氧化酶等，直接从前体化合物不对称合成各种复杂的手性醇、 酮、醛、酯、胺衍生物，以及各种含磷、硫、氮及金属的手性化合物。该法不需 制备前体衍生物，可将前体100％的转化为手性目标产物，因此具有更大的工业价 值。 依赖于NADPH的酮基还原酶在手性药物合成中的具有广泛的应用，象氨基酸 的生产，羟基酸的合成，醇类，醛类和酮基修饰，甾体转化等。RoCHBE是全合成 他汀类药物，L．camitine等的手性中间体，化学方法或先合成消旋体，再将消旋体 拆分，或进行不对称合成，这样无疑会增加技术难度和提高成本。因此如何对全 合成产物的旋光性进行控制是全合成他汀类药物的难题之一。本研究利用基因工 程重组的酮基还原酶转化COBE为R—CHBE。结果表明：工程菌的酶活较原始菌 的酶活高：缓冲液和底物浓度对转化反应有明显影响，当COBE的浓度高于 投料量，消除底物抑制和在水相中的不稳定性。产物CHBE主要存在于有机相(丁 酸乙酯)，便于产物的提取分离。 71