猪腮腺分泌蛋白在腮腺生后发育过程中表达特性探究.pdfVIP

猪腮腺分泌蛋白在腮腺生后发育过程中 表达特性研究 田兴华，樊宝良，李宁 中国农业大学动物科技学院，北京，100094 摘要：腮腺在消化中的地位和作用，决定了它具备研制生物反应器和进行抗病育种研究的良好条件。猪PSP基 因在腮腺中特异性表达[51，但PSP在不同发育期腮腺中的表达量尚无报道。本研究利用荧光定量PCR对PSP在猪腮 腺体外发育的不同阶段进行了研究，对猪腮腺分泌蛋白的研究将对腮腺生物反应器的研制及抗病育种的研究奠定良好 的基础。 关键词：腮腺分泌蛋白；表迭特性；腮腺体外发育；猪 唾液作为唾液腺的终产物，具有多种与消化相关的功能，包括对食物大分子的分解、润滑、口腔组 织的保护以及维持pH的平衡…。目前，唾液中的一些蛋白功能已经明确，但还有许多蛋白的结构和 功能是未知的。腮腺分泌蛋白(PSP)就属于后一类。腮腺分泌蛋白是唾液中表达量非常高的、组织特 异性表达的一种蛋白。到目前为止，已经有小鼠、大鼠、人和牛的PSP基因cDNA序列报道[2|，对其功 能的研究还非常有限，在体外实验中证明，人和小鼠PSP具有抗菌作用[3|。对小鼠PSP基因的研究较 为深入，已经有人利用小鼠的腮腺分泌蛋白的启动子和增强子区构建高效表达载体，获得了唾液腺特 异表达的转基因小鼠和转基因猪，充分证明唾液腺作为生物反应器是一条行之有效的途径[4]。， 猪的唾液腺由一对腮腺、下颌下腺和舌下腺组成。据估计，每头猪每天能分泌的唾液量高达 15LE 4l。过去的几年中，本实验室一直致力于对猪唾液腺进行研究，考虑到腮腺分泌蛋白在猪唾液中 的含量和可能的功能，唾液腺具备研制生物反应器的良好条件和进行抗病育种研究的良好基础，对猪 腮腺分泌蛋白的研究将对腮腺生物反应器的研制及抗病育种的研究产生深远的影响。 研究证明猪PSP基因在腮腺中特异性表达15』，但PSP在不同发育期腮腺中的表达量高低尚无报 道。因此，本研究利用荧光定量PCR对猪的腮腺分泌蛋白在猪腮腺生后发育的不同阶段进行了研究。 1材料与方法 1．1 实验动物 选用初生、5日龄、20日龄、42日龄、80日龄、150日龄的雄性大自猪，每个日龄各8头。 1．2组织样品 在无菌条件下，从刚屠宰的猪采取新鲜的腮腺组织样品，分装样品并立即放人液氮中，采取的组织 样品可在一80。C长期保存。 1．3引物的设计与合成 DNA为模板设计两对引 内含子，以避免可能残余的痕量基因组DNA对试验构成干扰。同时以lamda 物，用于建立标准曲线。引钫由上海生王生物公司畲成尊引糖序烈赡1ja 162 2005学术年会 1．4 Frr—P(渭初步鉴定表达量 因组污染和样品量的一致性。所用引物见表l。 1。5实时荧光定量PcR DNA 以不同稀释倍数的lamda 1kb片段为模板建立标准曲线，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) Green Master PCR 同发育期腮腺中的表达量。Q—PCR反应以SYBR Mix(AppliedBiosystems)作为报 7900HT 告系统，在ABI Q—PCR仪(Applied SYBRGreenPCRMaster Mix(Applied Q—PCR结果用AppliedBiosy-stems配备的SDS2．2软件进行分析。 表1用于盯一P氓及Q一嘲l的引物 2结果与分析 2．1 猪腮腺分泌蚤白在腮腺中高效表达 由于引物本身是跨越内含子的，因此以基因组为模板没有扩增条带出现，表明这些引物可以用于 响，这就保证了Q—PCR反应的高度特异性。，为了保证Q—PCR反应的准确性，我们用三磷酸甘油醛 脱氢酶GAPDH作为内标。由予GAPDH为持家基因，在同种动物、同一组织的不同发育期其表达量 达量，在此基础上计算PSP gene相对表达量的均值，并对二者进行比较。