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胶原蛋白热稳定性的酶法分析 段蕊l，张俊杰1，今野久仁彦2，吴美华1，陈烨l，叶超l (1．淮海工学院海洋学院，连云港，222005) 1) (2．北海道大学水产科学研究院，日本函馆，041．861 摘要：热稳定性是胶原蛋白的一个重要性质，与胶原蛋白的应用有密切关系。目前研究胶原蛋 白热稳定性的方法主要有差热分析法(DSC)、圆二色谱法(CD)、粘度法等方法，本研究采用 酶解法对冬夏鲤鱼鳞、鲢鱼鳞胶原蛋白热稳定性进行考察，结果表明，酶解法研究胶原蛋白的热稳 定性是可行的，该方法具有操作简便，结果直观等优点。 关键词：胶原蛋白稳定性酶解法 0前言 胶原蛋白是动物体内一种主要的结缔组织蛋白，是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白 质，广泛分布于动物皮肤、肌腱、韧带、软骨等组织和器官，是哺乳动物体内含量最丰富的一种蛋 白质，约占哺乳动物体内总蛋白的1／3。胶原蛋白是一种由三条螺旋状多肽链组成的线性大分子， 分子量在30万左右。I型胶原蛋白是胶原家族中含量最丰富的一种，由两条相同的Ql链和一条a2 链组成，每一条c【链自身为左手螺旋构型，3条n链又相互缠绕在一起形成右手超螺旋结构…，【2】o胶原 蛋白质结构和功能特点使得其在许多领域，如食品、药物、化妆品、生物医学材料、化工等领域具 有重要地位以及良好的应用前景。 胶原蛋白的热稳定性质和其应用有着密切的关系【3】，目前研究胶原蛋白热稳定性的方法主要有 差热分析法(DSC)【4|、圆二色谱法(cD)I51、粘度法等方法16|，DSC和cD法均需要相应的设备 支持，尤其是CD法，所需的设备昂贵，粘度法测定受影响的因素较多，测定的结果准确度欠佳。 本研究分别以冬季和夏季的鲤鱼鳞、鲢鱼鳞为原料提取酸溶性胶原蛋白，采用酶解法，结合 电泳技术，考察冬夏鲤鱼鳞、鲢鱼鳞胶原蛋白热稳定性的差异。 1．材料与方法 1．1原料 分别于2009年1月和7月采购同一来源的鲜活鲤鱼、鲢鱼。取鱼鳞，清洗干净后，提取胶原蛋白， 得到冻干样品。 1．2仪器设备 日本ATTO电泳系统(日本ATTO株式会社) 1．3胶原蛋白的酶解 将冷冻干燥的冬夏鲢鱼鳞胶原蛋白样品溶于醋酸溶液中，分别于26。C，28。C，30。C， 33C，35。C，40。C，50C各不同的温度下加热30min，加入胃蛋白酶酶解，电泳分析酶解物。 1．4电泳：参见方法[7】。 2．结果与讨论 分别采集的冬夏鲤鱼鳞，经过醋酸提取胶原蛋白并冻干后储存，作为研究胶原蛋白热稳定性的 原料。 12 2．1加热与未加热鲤鱼鳞胶原蛋白的酶解图谱的比较 将鱼鳞胶原蛋白加热使之发生解螺旋，并在冰浴中急速冷却，于样品中加入胃蛋白酶酶解， 酶解产物通过电泳进行分析，未经过加热的胶原蛋白经过胃蛋白酶酶解谱图作为对照，结果见图l。 酶解图谱显示，未加热的鲤鱼鳞胶原蛋白样品不能被胃蛋白酶酶解，图谱中旺和D链未出现断 裂，也没有酶解的肽段出现，这与以往的结论是一致的【8’91。即除胶原酶之外的其他蛋白酶，对于 具有完整三螺旋结构的胶原蛋白不具有分解的能力Il0’¨J。当把胶原蛋白适度加热变性后，再进行 酶解，酶解片段会随着酶解时间的延长逐渐增加，分子量也逐渐变小。 A B 且一—◆k-簟簟_一孥鳜 j 耋Iii薹薹； ul(o|3)一—◆ ■黼■■■■■■■㈡ 删黼 乜，／ )0。。oo#∞‰∞ 一 0 1 3 5 10 0 0．5 l 1．5 2 3 5 10 time(h) Digestion 图1．加热与未加热鲤鱼鳞胶原蛋白的酶解图谱 对比