CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法建立.pdfVIP

CSFV和PRRSV多重RT—PCR检测方法建立 曲哲会，郭晓秋，刘涛 (信阳农林学院动物科学系河南信阳464000) bp和294bp。检 bp、457 测结果显示，该方法具有高特异性，均可检测到l 学的检测，并且能够准确鉴别鉴定PRRSV为经典株及liP—PRRSV。 关键词：猪瘟；猪繁殖与呼吸综合征；多重RT．PCR 猪瘟(Classicalswine 以稽留高热、出血和高死亡率为主要特征【lJ。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and reproductiverespiration 特征的的传染病[2】o二者均为目前规模化养殖场的多发病，并且极易继发其他病原感染，加剧病症， 死亡率升高，严重影响养猪生产。因此，建立快速鉴别诊断这2种病毒的方法具有十分重要的意义。 病原学快速诊断方法。 1材料和方法 为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的PCR检测试剂盒阳性对照。 及其RNA酶抑制剂购自大连宝生物工程有限公司：胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。 CSFV RT—PCR检测试剂盒、PRRSV 盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。 kiP—PRRSV株PCR扩增结果分别为544 bp，CSFV毒株PCR扩增结果为294bp(表1)。 bp和457 引物由上海博距生物公司合成。 表1RT．PCR检测引物序列 病毒 弓|勃穿到 位置 产溉长菠 and ，Virus Namesequenceofprimers Position Size PRRSV-S：3-GTCAAGATGCGCCACGTC-52909～2926 544 bp(PRRSV) PRRSV PRRSV-A：3-CGAATGGTCCGCAAAGCG·53343～3360 457bp(HP-PRRSV) CSFV，S：3．GAATCTGGTGGGTCCCTC．5148～165 CSFV 294 b’p CSFV～A：3一GTTACCCTCACCTCCTTGG．5423--44】 1．4病料处理及病毒基因组RNA的提取可选择血清、肺脏、淋巴结和流产胎儿组织作为检测病料， 处理方法参照文献吼参照试剂盒说明书上的方法，应用Trizol试剂盒提取病料或病毒总RNA，。70 ℃条件下保存。 317 1．5单项RT．PCR反应过程 1．5．1RNA的反转录 反转录说明书方法进行反转录制备cDNA。 1．5．2 10xPCRBuffer2．5 2．0 gL，4xdNTPgL，DNA模板2．0gL，TaqDNA聚合酶O．25btL，加超纯水使总 min，94℃30S，53℃25S，72℃30 反应体积为25止。PCR反应程序均为94℃5 S，进行30 循环，最后72℃7 物技术公司完成序列测定。 ， 转录过程中同时加入下游引物PRRSV．A和CSFV．A各2