变形链球菌葡聚糖结合蛋白B功能区片段克隆、原核表达和防龋初步研究.pdfVIP

2005年全军口腔医学学术会议论文摘要汇编·西安 法】以人全基因组DNA为模板，通过PCR方法获得目的片段，将其连接到PKey-TA载体进行测序， 并对所获得的序列进行生物学信息分析．将不同启动子片段构建至报告基因载体l】GL3-Basic中。 瞬时转染至牙髓干细胞，荧光素酶检测启动子活性并进行分析。【结果】从人全基因组中获得2．2kb 大小的目的片段。测序结果与基因组相应序列吻合。酶切鉴定表明不同长度启动子报告基因载体构 建成功，荧光素酶分析结果显示：不同片段的Dmpl启动子在牙髓干细胞中活性不同，-505--一193 区为Dmpl启动子的核心启动子区。【结论】成功克隆到Dmpl上游启动子的序列，该启动子区在牙 髓干细胞中具有活性，为研究Dmpl基因在成牙本质细胞分化和牙本质矿化中转录调控机制奠定了 基础。 远缘链球菌细胞分裂蛋白ftsK功雒的初步研究 金涛，吴补领，苏凌云 (第四军医大学口腔医学院．陕西西安710032) 龋病实质是细菌感染性疾病。目前防龋的研究主要集中在链球菌在牙面的粘附、聚集及增殖机 理几个环节进行，对致龋菌本身增殖过程中基冈调控机理研究较少。本研究以远缘链球菌的细胞分 裂蛋白ftsK为研究对象，对ftsK基因进行分子克隆．并在大肠杆菌中进行了蛋白的表达，纯化和 抗体制备；在远缘链球菌中使i*AK过表达。并观察了其对远缘链球菌生长的影响：最后在体外构 筛选出的ftsK基因失活菌株进行了鉴定。观察了该菌的生长情况．主要实验结果如下： 1．利用PcR技术．克隆远缘链球菌RsK基冈．序列分析正确。 2．构建ftsK的原核表达质粒pPROEXTMHTb—ftsK。并住人肠杆菌表达。 3．用金属蝥合亲和层析方法纯化ftsK融合蛋白． 4．制备了ftsK融合蛋白的多克隆抗体。 长情况发现细菌的分裂受抑制。 株不能完整的表达ftsK蛋白；通过斑点杂交鉴定和Southem杂交从分子水平上对其加以验证。观 察该菌的生长发现细菌分裂受到阻滞。 变形链球菌葡聚糖结合蛋白B功能区片段克隆、 原核表达及防龋初步研究 张敖吴补领苏凌云 0032) (第四军医大学口腔医学院，陕西西安71 龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一，葡聚糖结合蛋白(Gbps)作为变形链球菌表面的膜 受体，能够与吸附于获得性膜内的葡糖基转移酶所合成的葡聚糖特异性结合，对细菌的初始粘附、 42 2005年全军口腔医学学术会议论文摘要汇编·西安 聚集起重要的作用，是变形链球菌重要的毒力因子。葡聚糖结合蛋白B(GbpB)由于其良好的免疫 原性，在免疫防龋研究中受到越来越多的重视。目前国内外的研究多集中于GbpB的全长基因，对 列，人工合成两段肽段SYI和QGQ，取得了较好的免疫原性和防龋效能。 区原核融合表达质粒，将酶切鉴定正确的阳性克隆进行序列测定，测序结果与文献报道一致，获得 了GbpB功能区基因片段。 将原核融合表达质粒，转化至E．coliBL21，通过IPTG诱导表达GbpB功能区融合蛋白，通过 金属螯合亲和层析法(Ni2-NTA介质)获得了纯化的GbpB功能区蛋白，分子量约为9KD。 纯化的GbpB功能区蛋白进行葡聚糖结合功能实验。将葡聚糖凝胶G一15与纯化的功能区蛋白混 匀，去离子水充分洗涤后行SDS—PAGE电泳，结果表明功能区蛋白具有一定的葡聚糖结合功能。 用纯化的GbpB功能区蛋白及GbpB全长蛋白通过腺周皮下注射途径免疫大鼠，分别采集第14d、 并与GbpB全长蛋白免疫组进行比较，实验结果显示，GbpB功能区蛋白注射组引发了高浓度的抗自 身特异性血清IgG和唾液IgA抗体，并且此抗体可以和GbpB全长蛋白发生抗原抗体反应，其抗体 效价高于GbpB全长蛋白注射组。说明GbpB功能区蛋白不仅具有刺激产生抗自身抗体的抗原决定簇， 而且与GbpB全长蛋白具有交叉的抗原决定簇，并具有更好的免疫原性。 建立定菌鼠致龋实验模型，用纯化的GbpB功能区蛋白和GbpB全长蛋白通过腺周皮下注射途径 免疫定菌鼠，采用