小细胞肺癌标志物-人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因的分子克隆、抗体制备和其在肿瘤中的表达检测.pdfVIP

N LM C 论文汇编 MLCCCC4002 CB-8 小细胞肺癌标志物一人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因的分子克隆、 抗体制备及其在肿瘤中的表达检测 张青云 北京大学临床肿瘤学院，北京肿瘤医院检验科100036 朱爱萍山西医科大学第二医院检验科 王雅明徐建军王力民邓丽娟任颖佳 北京大学临床肿瘤学院，北京市肿瘤防治研究所免疫研究室 enolase，NSE)广泛6主要设备 神经元特异性烯醇化酶(Neuron—specific PCR仪：PTC一200PehierThermal 3000X电 分布于人类及各种动物的成熟神经元、周围神经的神经内分泌细 Cycler。Model 胞和一些感觉细胞中，其对低氧层的神经元有神经营养和保护作 泳仪：Bio—RadCo．Modd200／20。UVtransillumilatorandcam— 用。它在正常人脑组织中含量最高。起源于神经内分泌细胞的肿 MDGEl 瘤组织也有异常表达，常见于神经母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺 公司。C02培养箱：Hereusinstruments。电转膜仪：2051 癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤等。NSE可与其他肿瘤标志物联合作为MuhiBlot．LKBromma公司。 二、实验方法 小细胞肺癌(SCLC)的肿瘤标志物，用于对SCLC的鉴别诊断，放 化疗效果、预后、恶变情况等的监测。近年来国外正在从多方面对 1人NSE基因的克隆及重组质粒的构建 其进行全面深入的研究，而国内对于NSE基因的研究尤其是临 床诊断及治疗方面的研究还很薄弱。本研究目的是利用RT-PCRA549细胞提取总RNA，逆转录合成NSE 技术克隆人NSE基因，将其克隆于pMS一3lb原核表达载体，经热 诱导表达NSE融合蛋白。利用杂交瘤技术进行抗NSEMcAbs的 研制，以便对NSE在临床诊断及预后预测中的意义进行深入的其基因序列的正确性。然后将NSE基因定向克隆于原核高效表 研究。 材料与方法 一、实验材料 经酶切鉴定。 1．寡核苷酸引物设计及合成 2 MS2一NSE融合蛋白的表达、纯化 选择酶切鉴定正确的阳性菌扩大培养，经42℃热诱导，大量 根据已知人Neuron—SpecificEnolase(NSE)基因序列合成其 上、下游引物，上游引物为5’GAAmATGTCCATAGAGAA— GATcTG3j下游引物为5’TCTAGAAGAGGAATCACAGCA— CACTG3’f上海申友生物技术公司合成)。 化、蔗糖浓缩及PBS透析后，光密度法测定其含量。 2菌株、表达载体及分子克隆试剂 3鼠抗人NSE杂交瘤细胞株的建立 初次免疫时将MS2一NSE蛋白与福氏完全佐剂等量混合，腹 大肠杆菌菌株JMl09、POP2136和原核表达载体pMS一31b DNA 由北京市肿瘤研究所免疫208室保存；dNTPs、DeepVent DN