实时荧光RT-PCR快速检测猪瘟病毒的研究与应用Ⅰ.实时荧光RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 物机体免疫应答效应十分明显。 ‘ · 5．3 作为猪瘟诊断试剂所需阳性血清少，选用猪瘟弱毒冻干苗价廉易得，安全可靠，健康家兔对猪瘟 弱毒株敏感，便于操作。首次接种兔体产生显著的体温反应，强烈刺激机体免疫应答。 5．4我们曾用弗氏不全佐剂乳化猪瘟弱毒冻干苗接种过一批断奶仔猪，结果表明耳根肌内接种1次4 头剂／头，30天后采血用猪瘟正向间接血凝抗原检测，猪瘟抗体效价可达l：128-～l：512，而对照组仅用 生理盐水稀释的猪瘟弱毒冻干苗的抗体效价只有1：8～1：32。由此可见油包水剂型的猪瘟弱毒冻干苗接 种仔猪佐剂效应也很显著。 5．5猪瘟正向间接血凝抗原适用于检测猪瘟免疫抗体效价。1993年以来，我们使用该抗原检测过各 地送检血清数千头份，发现有的猪场饲养的保育仔猪(断奶7～15天)猪瘟抗体效价均低于l：16，询问 畜主都回答接种过抗猪瘟疫苗，究其原因可能是生产这些仔猪的母猪或公猪系猪瘟隐性带毒者，通过垂直 传播方式感染仔猪，由于断奶后母源抗体逐渐消失，从而发生“免疫偏离现象”，这些仔猪较易发生“温和型” 猪瘟，应提高警惕，及时采取有效措施，避免疫情暴发。 参考文献略 实时荧光RT—PCR快速检测猪瘟病毒的研究与应用 ．I．实时荧光RT—PCR检测猪瘟病毒方法的建立 蒋春燕王琴范学政徐璐王泰健孔鹏宁宜宝宋立刘义鸿 (中国兽医药品监察所北京100081) 序列进行综合排列、比较，同时为保证猪瘟荧光探针的特异性，避开与BVDV同源部分，设计了5针对猪 瘟病毒的特异性探针和引物。通过对5对探针和引物的筛选，同时对反转录酶浓度、上下游引物浓度和探 针浓度的进一步优化。在敏感度试验方面，与标准中的HCFA方法符合率为83％，较HCFA方法敏感；． 较常规Nest-PCR方法敏感100倍；在其它病原体的特异性试验中，该方法具有很强的猪瘟病毒特异性； RT-PCR 在与进口一步法试剂Ready．To．Go 应耗费成本多方面比较中体现了荧光RT-PCR检测猪瘟病毒的优越性，初步建立了特异、灵敏、快速的猪 ‘ 瘟病毒实验室诊断方法。 ’ 。 关键词荧光RT-PCR一步法猪瘟病毒 SwineFever 。猪瘟病毒(Classical 猪业造成严重的经济损失。该病毒与牛病毒性腹泻病病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)和羊边 界病病毒(Borderdiseasevirus， 它们的核酸序列同源性高。猪瘟病毒是具包膜的正链RNA病毒，长度大约为12．3Kb，含有一个大的阅读 框，具有高度保守的5’和3’端非编码区。 近十几年来，由于病毒学、组织培养技术、生物化学技术、单克隆抗体技术和基因工程的迅速发展¨1， 推动了猪瘟的病原防制技术研究的发展，对猪瘟病毒分子、流行病学、免疫基因的结构与功能、抗原表位、 诊断以及防制技术等方面都有了许多新的进展与成就。由于猪瘟病毒在细胞内繁殖滴度较低，并且不产生 肉眼可见的病变，对病原的进一步研究尤其是诊断技术的研究带来了难度，致使目前猪瘟的诊断技术研究 349 猪传染病 依然存在许多问题，各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、非特异性反应较严重等诸多问题。虽然 用套式PCR方法在一定程度上可以解决模板浓度过低的问题，但也是受浓度限制的，导致反应在灵敏度上 受到～定的影响；此外套式PCR除了常规反转录、二次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，耗时太长不利于实 验室快速检测猪瘟病毒；而免疫荧光技术(HCFA)技