人颗粒酶a活性段的表达、纯化及其活性鉴定【精选】.pdfVIP

胡雪菲等 人颗粒酶 A活性段的表达 、纯化及其活性鉴定 第 l期 doi：10．3969／j．issn．1000-484X．2015．01．016 · 免疫 学技术与方法 · 人颗粒酶 A活性段 的表达、纯化及其活性鉴定① 胡雪菲 江文正 (华东师范大学 生命科学学院上海 200241) 中图分类号 R392．11 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2015)01-0077-05 [摘 要] 目的：克隆和表达人颗粒酶A(GranzymeA，GzmA)基因的活性片段 (activeGranzymeA，aGzmA)并进行活性 鉴定。方法：以全长人GzmA基因为模板，PCR扩增aGzmA基因片段，限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切后插入原核表达载 体 pET24a(+)，将重组质粒转化大肠杆菌BL2I(DE3)，IPTG诱导表达 ，表达产物经 SDS．PAGE和Westernblot进行分析。重组 蛋白用镍层析柱亲和层析进行纯化后，利用BLT底物溶液进行活性鉴定。结果：PCR扩增得到长约700bp的基因片段。重组 质粒 pET24a—aGzmA经酶切和测序证实 aGzmA基因序列正确插入载体质粒中。SDS—PAGE显示在26kD处有一特异性蛋白 条带。Westernblot证实该蛋白可与小鼠抗 His单克隆抗体发生特异性结合。利用镍柱亲和层析法可从包涵体中纯化得到纯 度较高的重组蛋白，且具有较好的酶活性。结论：成功制备了具有生物学活性的人颗粒酶A重组蛋白。 【关键词] 颗粒酶A；克隆；大肠杆菌；表达；活性测定 Expression，cloningandactivityassayofactivedomainofhumangranzymeA HUXue—Fei，珏 NGWen—Zheng．SchoolofLifeSciences，EastChinaNormalUniversity，Shanghai200241，China [Abstract] Objective：TocloneandexpressactivedomainofhumanrganzymeA(aGzmA)anddetectitsbiological activity．Methods：HumanaGzmA genewasamplifiedbyPCR from thefull-lengthhumangranzymeA andinsertedintoprokaryoticex— pressionvectorpET24a(+)．TheconstructedrecombinantplasmidpET24a—aGzmAwastransformedtoE．coliBL21(DE3)andinduced withIPTG．TheexpressedproductwasidentifiedbySDS—PAGE andWesternblot．TherecombinantproteinwaspurifiedbytheNi affinitycolumnchromatographyand the enzymeactivitywasassayedwithBLT substrate．Results：A DNA fragmentof700 bpwas amplifiedbyPCR．Therecombinantplasmid pET24a-aGzmA identifiedby enzyme—digestinganalysisand sequencingshowed that aGzmA genewasinserted intovectorplasmidcorrectly．SDS—PAGE analysisshowedthattherewasaspecificproteinwitharelative molecularmassofabout26kD．Westernblotanalysisindicatedthattheproteincouldreactwithmouseanti—Hismonoclonalna tibody specifically．Therecombinantprotein with high purity could be acquired from the inclusion bodiesby the Ni。 affinity column chromatographyand thepurified protein had good enzyme activity．Conclusion：The recombinanthumna granzyme A with goo