pE6／p53／GFP重组真核表达载体的构建及其对肺腺癌细胞周期的影响.pdfVIP

维普资讯 第 29卷第 24期 第 三 军 医 大 学 学 报 Vo1．29，No．24 2007年 12月 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MIUTARIS TERTIAE Dec．2007 2323 文章编号：1000-5404(2007)24-2323—04 论著 pE ／p53／GFP重组真核表达载体的构建及其对肺腺癌细胞周期的影响 毛丽伟，王卫东，李德志，陈正堂 (第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所，重庆400037) 提 要：目的 构建放射诱导启动子序列所调控的wt—p53抑癌基因的真核表达载体 pE一p53／GFP，并研究其功能。 方法 全基因合成方法获得放射敏感性增强子E；PCR法从pcDNA3．1(+)／p53质粒中扩增p53cDNA全长序列；双酶切 IRES一EGFP双顺反子表达载体，获得 IRES：一EGFP报告基因片段，以pCI—neo为载体构建重组pE ／p53／GFP。重组体经双 酶切、测序鉴定其正确性。采用脂质体法将重组质粒转染 H1299(p53 一)细胞，G418筛选出稳定表达细胞株。RT—PCR 分析基因整合；Westernblot方法分析不同放射剂量后P53蛋白表达情况及持续时问；流式细胞技术分析E对肺腺癌细胞 周期的影响。结果 正确构建pE／p53／GFP重组质粒，并在被转染细胞核内检测到p53基因表达；4Gy照射 12h后 p53 基因表达显著增强；放疗后转染组细胞发生显著G。期阻滞，克隆形成率下降。结论 成功构建了放射反应元件E控导的 pE6／p53／GFP重组质粒。 关键词：放射敏感性增强子；RT—PCR；Western blot 中图法分类号：R394—33；R730．23；R734．2 文献标识码 ：A Construction ofeukaryoticexpressionvectorofpE6／p53／GFP and itsinfluenceon cellcycleoflungadenocarcinoma MAOLi—wei，WANGWei—dong，LIDe—zhi，CHENZheng·tang(CancerResearchCenter，XinqiaoHospital，ThirdMilitaryMedi— calUniversity，Chongqing400037，China) Abstract：Objective Toconstructthewt—p53’seukaryoticexpressionvectorpE6／p53／GFPthatwas controlledbytheradiationinducedpromoterandresearchitsfunctions．Methods Radiationresponseelement E6wassynthesizedbygenesynthesis．Thewt—p53cDNA sequencewaspreparedfrompcDNA3．1(+)／p53 plasmidbyPCR．IRES2-EGFP report genesegmentwaspreparedrfom doublecistronexpressionvectorIRES2一 EGFP byenzyme digestion．Aftersequenced and identified，therecombinantplasmid wastransformed into H1299(p53√一)cellwithLipofectamine2000，andthecelllinesinstableexpressionwasscreenedbyG418． IntheH1299(p53 一)celltransfectedwiththerecombinantplasmidorwithout，wt