不同激活方式对猪卵母细胞孤雌发育影响.pdfVIP

第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 不同激活方式对猪卵母细胞孤雌发育的影响 付博1，赵金凤2，房庆昌2，任亮2，马红3，李忠秋3，郭镇华3，刘娣3 1东北农业大学生命学院，哈尔滨150030；2’东北农业大学动科学院；3’黑龙江省农业科学院畜牧所150086 关键词：猪；卵母细胞：电激活；孤雌胚发育 引言 本研究以孤雌激活的卵母细胞为研究激活效率的模型，优化脉冲强度等参数，结合CB，6-DMAP，CHX 进行脉冲刺激后化学处理，旨在摸索出一套适合本实验室条件的激活体系，从而为猪体细胞核移植等技术和 机理的研究提供必要的方法和手段。 材料方法 抽取卵巢上直径3～6 IU／mL孕马血 ng／InL表皮生长因子(EGF)+10 ％猪卵泡液(pFF)+o．57mmol／L-半胱氨酸(L-cysteine)+10 h后，挑选排出第一极体的成 清促性腺激素(PMSG)+10IU／mLl人绒毛膜促性腺激素(hCG)。成熟培养42 熟卵母细胞，0．1％透明质酸酶消化10min，去除卵丘细胞。先用39℃预温的激活液洗涤3遍。实验一：1 次脉冲，1．6、1．8、2．0kV／cm的脉冲场强和20US、30us、40US的脉冲时程进行电脉冲刺激，每个处理重复3 次。实验二：采用试验一中的最佳激活参数，配以I，2，3次脉冲进行电脉冲刺激。每个处理重复3次。实 验三：采用试验二的最佳激活参数，配以2mM6．DMAP，10 CHX处理4h。单独电 ug／mLCB和10ug／mL 脉冲组(EP)作为对照组。每个处理重复3次。然后用胚胎培养液洗2～3次，最后移入50止／滴的胚胎培养 液中培养，第48h检查卵裂率，第168h检查囊胚形成率。 结果 kV／cm时，囊胚率有随脉冲 当场强较低时，’囊胚率有随脉冲时程的延长而升高的趋势；但场强大于1．8 时程的延长而下降的趋势。在脉冲次数为l时，本研究场强和脉冲时程范围内的卵裂率无显著差异。采用试 验一中的最优脉冲参数，分别施以1，2，3次脉冲时，三组处理差异显著；且随着脉冲次数的增加，卵裂率 组囊胚率差异不显著(P0．05)。 讨论与结论 试验一中各处理的卵裂率无显著差异，这可能是本试验中使用的融合液中Ca2+浓度过高造成的。Ca2+ 浓度对孤雌胚发育的影响还有待进一步研究。脉冲产生的孔洞是暂时性的。如果场强，时程和脉冲次数适当， 电脉冲造成的创伤是可以恢复的，不会对胚胎的后期发育产生严重影响；但如果场强过强，时程过长或脉冲 次数过多会对胚胎后期发育产生不利影响；反之，如果场强过弱，时程过短又达不到有效激活的效果。本研 US、30US、40 细胞内Ca2+浓度达到有效激活卵母细胞的水平；而场强为2．0kV／cm，脉冲时程为20 US的处理 组合囊胚率也不高，可能是由于脉冲强度过高，造成卵母细胞不可逆的创伤，进而影响囊胚的形成率。场强 为1．8kV／cm，脉冲时程为30US，脉冲次数为2，3次的处理组合囊胚率和卵裂率均不高，可能是由于脉冲次 数过多，对卵母细胞造成伤害过大，进而影响胚胎的后期发育。试验结果表明：脉冲次数不宜超过2个。综 US，脉冲次数1次。CHX和6-DMAP 上所述，本试验摸索出的最佳电激活参数为：场强1．8kV／cm，脉冲时程30 是辅助激活剂，这两种物质作用缓慢，且主要抑制MPF的生成，对已有的MPF作用较小，所以单独使用时并不 能激活猪卵母细胞。而当电击激活和化学激活联合使用时，若先用电击激活降低MPF的水平，再用6-DMAP和 CHX维持这个低水平，就能更加有效地激活卵母细胞。CB联合处理可使细胞骨架松弛，破坏纺锤体的形成， 抑制极体的形