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食管癌组织中SP细胞依赖于P13K／Akt通路 李红霞郭黎平陆士新 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 目前对于肿瘤干细胞仍然是很多研究者所共同关注的一个热点领域，至今已经在多种肿瘤中分离鉴 定出了肿瘤干细胞，包括血液系统肿瘤和多种实体瘤，例如白血病，乳腺癌，脑胶质瘤，前列腺癌，等 等，并针对肿瘤干细胞的生物学特性进行深入的研究。食管癌在我国是常见肿瘤，多数对放化疗反应不 敏感，预后较差。对食管癌肿瘤干细胞的研究将会对食管癌发病机理及治疗提供有利的理论依据。侧群 细胞(sP细胞)是现在肿瘤干细胞研究中的一个常用的方法，用于富集肿瘤干细胞。 一材料和方法： 我们选择肿瘤医院食管癌手术新鲜组织标本，经过剪切，消化后培养，经过几代的传代培养，得到 一定数量的原代培养肿瘤细胞，用于实验的细胞均为自组织原代培养二十代以内的细胞。得到足够数量 的细胞后进行染色，上机进行SP细胞的分选，得到的SP和NSP细胞收集后用于进一步实验。经过进一 步的试验，包括软琼脂集落形成，化疗药物敏感型检测，ABC家族基因表达情况，免疫缺陷鼠体内成瘤 实验等证实取材自原代组织培养得到的肿瘤细胞中存在sP细胞，且SP细胞具有肿瘤干细胞样特性。进 一步实验验证P13K／Ah通路对于维持SP细胞的比例中的作用，通过各种通路抑制剂的作用效果判断各 种通路对sP细胞的作用，并进一步的研究其下游信号分子的具体作用。 二结果： 在手术中取到的肿瘤组织标本共8例，其中有3例能够得到较好的培养贴壁细胞，能够进行十次以 上传代，得到足够用于分选的细胞。经过Hoechst染色的细胞，进行流式分选，三个组织培养细胞中均能 检测到SP细胞，比例在1％．3％左右，经过软琼脂集落形成实验，证实SP细胞较NSP细胞具有更强的体 外软琼脂集落形成能力(11％vs4．2％)，经统计学分析差异具有显著性。化疗药物敏感性实验证实sP细胞 对顺铂，硼替佐米的药物面感性均明显低于NSP细胞。免疫缺陷小鼠的体内成瘤实验证实SP细胞的成 个月时间，却只有一只小鼠形成肿瘤。 进一步的实验通过使用信号通路抑制剂对细胞的处理，研究P13l【／A虹通路在维持SP细胞的比例中 inhibitor 所起到的作用。选用该通路抑制剂LY294002，AktIV,这几种Akt通路的特异性抑制剂来阻断Akt 通路的活性，经过抑制剂的处理，原本约2％左右的SP细胞比例较对照大大减少，甚至完全消失。由此 证明SP细胞的存在是依赖于P13黜通路的。 三讨论： 肿瘤已经成为威胁人类健康的重要病因，如何更好的认识肿瘤的病因，找到肿瘤发生发展中的关键 作用因素，仍然是从事肿瘤研究的科研人员为之努力的方向。肿瘤干细胞学说是近年来对于肿瘤认识的 一个干细胞学说，该学说认为肿瘤组织本身是一个异质性的多种细胞的集合，组成肿瘤的细胞中存在阶 层性。只有一小部分的细胞可以自我更新维持自身的数量和特性，同时可以不断分裂、增殖、分化，形 成其他成分的肿瘤细胞，这样一小群细胞即被认为是肿瘤干细胞，在肿瘤的起源、进展、转移等过程中 均有重要的作用。现在已经在白血病和多种实体瘤中分离鉴定出肿瘤干细胞，多数具有比较明确的细胞 内外实验证明这些细胞具有自我更新的能力，并能够在体内实验中形成新的肿瘤。肿瘤干细胞为肿瘤的 研究和治疗提供了新的思路和有力的靶点。在没有明确细胞表面标志的肿瘤中，SP细胞为富集肿瘤干细 胞提供了较好的一个方法，也是国内外研究肿瘤干细胞时较为常用的分离方法。 食管癌在我国仍然是高发肿瘤，至今对于食管癌组织来源的干细胞研究未见报道。我们通过食管癌 组织取材，原代培养，分离富集SP细胞。我们的实验结果证明，食管癌原代培养细胞中存在sP细胞， 并且SP细胞具有肿瘤干细胞样的特性。不仅如此，我们还深入探讨了维持食管癌SP细胞的关键通路， 并证明P13K／Akt通路对于食管癌sP细胞的维持是必须的，该通路的失活直接导致SP细胞的减少甚至比 例消失。该结果对于进一步研究食管癌干细胞，以及未来针对干细胞的治疗都有重要意义。