SYBR+Green+I实时PCR对猪细小病毒体外复制动态探究.pdfVIP

457 养猪生产与猪病防治专题 o T030099 SYBRGreen I实时PCR对猪细小病毒体外复制动态研究 顾 帅 _-E)ll庆王新卫赵军 陈 陆杨 霞常洪涛 (河南农业大学，河南郑州450002) 目的 猪细小病毒几乎能在所有猪原代细胞和传代细胞上生长繁殖。目前主要通过免疫荧光方法或 细胞病变观察来了解病毒在体外的复制情况。但上述方法仅能反映病毒在空间E的复制状况，而 不能准确反映病毒在细胞内的增殖规律及向细胞外释放病毒的动态变化规律，往往错过收获病毒 的最佳时期。而实时PCR方法可很好的克服这些问题，其能在不同时间点准确测定病毒复制的拷 贝数，从而了解病毒的体外复制动态。鉴于此，本研究在参考前人的基础卜建立检测PPV2基 vp Green 因的SYBR I实时PCR方法，研究PPV的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依 据。 材料方法 2基因序列，设计一对特异性引物，建立检测PPV 根据已经发表的猪细小病毒(PPV)的vp Green 的SYBR 究。 结果 Green 本研究建立了检测PPV的SYBRI实时PCR方法，其最小检出量为12个PPV拷贝。模 板浓度在108范围内稀释呈良好的线性关系，与PCV 应用本方法对HNZK．1株在PK．15细胞上的复制动态进行了研究，并首次绘制了病毒的体外增殖曲 线：细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降，随后开始逐步增加。接毒后84h培养液中病毒含量 量达到最高点(7．626x1010拷贝)，随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内 从细胞聚集、开始形成蚀斑到约80％的细胞病变产生。108h之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外 病毒数量都开始急剧减少。 讨论 目前判定猪细小病毒增殖效果的标准方法是测定其TCID50，但是该方法比较费时、费力，而且 不能精确定量。而荧光PCR更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动 Green 态规律。笔者所建立的SYBR I实时PCR可检测PPVHNZK一1株在PK．15细胞上感染后的复 制增殖状况，而且具有较好的特异性和敏感性。通过该方法，笔者也首次绘制了PPVHNZK．1株在 PK．15细胞上的增殖曲线，并利用病毒拷贝数定量的方法确定了HNZK—l株最佳的接毒方法和接毒、 458。蟋》2011年学术年会 收毒时间，为疫苗的生产提供了科学依据。该方法还可用于本病体外抗病毒药物的筛选、研制和作 用机制研究。 参考文献 chainreaction forthe TW,OraveerakulK detectionof 【1】Molitor ZhangQQ，eta1．Polymerase amplification porcineparvovims 1． 【J】．Vir01．Methods．1991，32：201-21 a1．Detectionof a real—timePCRwith and [21 C，Zhu C，et parvovirususingtaqman—based probe Song C，Zhang porcine primers fortheNSl J．2010．2：