多重RT—PCR检测猪流感病毒及血清亚型.pdfVIP

1262 中国兽医学报 2008年11月 第28卷 第 ll期 ChinJVetSciNov．2008 Vo1．28 No．11 多重RT—PCR检测猪流感病毒及血清亚型 刘惠莉，周宗清，邢继兰，潘 洁，杨秋峰 ，饶柏忠 (上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育 种重点实验室，上海 201106) 摘要：根据 GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因，H1、H3亚型 HA基因，Nl、N2亚型NA基因核苷酸 序列，经DNAstar软件类比选择保守区设计引物，sPCR筛选出引物对，用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1／ H3亚型、神经氨酸酶 N1,／N2亚型基 因片段 。根据 NP、H。N 、H。Nz亚型 引物扩增片段大小和反应条件的差异 ，将 各 引物配比组合 ，形成 引物组合 ，建立 多重 RT—PCR体 系。经对不 同亚型模板 的扩增 、检验 ，建立的 2个多重 RT— PCR体系可用于猪流感病毒及 H1／H3血凝素亚型、N1／N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测 多重RT—PCR不能扩增其他猪病毒核酸，核酸的最低检测量达 0．2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉 试子等 85份 ，与鸡胚分离及血凝 ／血凝抑制试验 比较 ，阴性样 品检测符合率达 100 。 关键词 ：猪流感病毒 ；血凝素亚型；神经氨酸酶亚型；多重 RT—PCR 中图分类号：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号：1005—4545(2008)l1—1262—04 DetectionofswineinfluenzavirusanditssubtypebymultiplexRT-PCR LIU Hui—li．ZHOU Zong—qing，XING Ji—lan，PAN Jie，YANG Qiu—feng，RAOBai—zhong (Shanghai MunicipleKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineering，ShanghaiInstituteofAnimalScience andVeterinaryM edicine。SAAS，Shang。hai201106，China) Abstract：Accordingtotheconservedregionsofswineinfluenzavirus(SIV)nueleocapsid (NP)，hemagglutinin (HA)．neuraminidase(NA)geneofdifferentH1 ．H3andN1 N2subtypes，twomultiplexRT—PCRassaysspe— cificforSIV NP H1H3，andN1N2weredeveloped．RTPCRproductswithuniquesizescharacteristicofeach subtypeofinfluenzaA virusweresequenced，and thesequencesweredemonstratedto be specificforH1N1or H3N2．GenomicRNAsorDNAsfrom fourcommon swinepathogensotherthantypeA influenzaviruseswerenot amplifiedwhichtheRT PCR assayswereperformedwiththeseprimersets．Positiveamplificationreactioncouldbe visualizedwithRNA extractedfrom upto10 dilutionofeachreferenceviruswiththeRNA concentrationof0．2 ng．Offivesamplesmixedwithvirusartificially，SIV H1N1and H3N2wereallpositive．W hileofthe85samples tested．nopositiveSIV H1N1andH3N2weredetected．TheresultsofnmhiplexRT—PCR were100 inagreement withthoseofvirusisolation inSPFchickenembryostogetherwith HA and