肝肾微粒体1型抗原的制备及纯化.pdfVIP

放射免疫学杂志2013年第 26卷第2期 JofRadioimmunology2013，26(2 一 211一 [DOI]10．3969／j．issn．1008-9810．2013．02．051 肝肾微粒体 1型抗原的制备及纯化 深圳市宝安区人民医院(518101) 叶国强 刘香萍 曾东良 谢春英 在 1973年，Rizzetto用间接免疫荧光法发现了与近端肾 ⑤挑菌接种于含 1001xg／mlAmp的 10mlLB液体培养基中 小管和肝细胞胞浆反应的自身抗体 。这些针对细胞内质 37℃过夜培养。取200 菌液转接种于含 lO0~rdAI印 的 网反应的自身抗体被命名为肝肾微粒体抗体 (LKM)，随后鉴 10mlLB液体培养基的锥形瓶中，180r／min，37c震荡培养，当生 定出LKM抗体有3种亚型，LKM一1、LKbl-2和LKM-3。LKM一 长到0D 为0．4h～O．6h，加入终浓度为 irmml／L的矾 ．G进行 1是 Ⅱ型自身免疫性肝炎(AIH)的血清学标志 。 诱导表达，诱导时间为4h，之后进行SDS—PAGE凝胶电泳。 细胞内质网包含两个主要 的酶家族，即细胞色素 P450s 1．2．2 融合蛋白纯化 本实验纯化条件选择天然条件下纯 (cYP)和UDP-glucurinidation(UGTs)，它们是代谢过程 I期 化蛋白，具体操作如下： 和Ⅱ期中的主要参与者。1989年，鉴定出细胞色素P4502D6 ①冰上解冻细菌，用 BufferNPI．10重悬，每 g湿重用 (2 (cYvzn6)是LKM—l的主要 自身抗原。LKld一1抗原的制备 ～ 5)rnl。需要多少细胞取决于蛋 白的表达水平和使用的表 及纯化将有助于建立特异的诊断自身免疫性肝炎的方法，为 达系统。 进一步研究 LKM-1自身抗体在AIH发病机制中的作用打下 ②加入溶菌酶终浓度 1mg／ml(50000单位／IIl1)冰上孵育 良好的基础 。 30rain，冰上超声波破碎，用200W一300W 的脉冲，每个脉冲 间隔10s的冷却期。 l 材料和方法 ③4℃，10000r／min离心菌液(20～30)rain。用 BufferNPI-10 1．1 实验主要材料 吸满系统泵，caltridge连接泵的出口，小心操作，不要让气体进入 1．1．1 重组的质粒 pGEX5X-1／CYP2D6、大肠杆菌 Y1090 系统。移去伽 dge出口的塞子，连在系统的管子上。 ④10倍体积Buffer平衡cartridge，1ml／min。使用系统泵 由本实验室提供。 1．1．2 EcoRI酶、酶标抗体购 自Sigma公司，其余试剂为进 载人清澈的细胞液进入cartridge。保证 目标蛋白吸附在 Ni- NTA基质上，保留流出的部分作为SDS分析。 口、国产分析纯或优级纯。 ⑤用 Buffer—NPI20填满系统泵，冲洗 (Wash)car- 1．2 方法 tridgel0min。 1．2．1 质粒pGEX5X-1／CYP2D6在大肠杆菌Y1090中的表达 ⑥用Buffer-NPI250从 cartridge洗脱 目的蛋白，目的蛋 1．2．1．1 大肠杆菌Y1090感受态的制备 白一般会被(5～1