紫花苜蓿光敏色素A基因片段的克隆和其RNA干扰载体的构建.pdfVIP

紫花苜蓿光敏色素A基因片段的克隆及其 RNA干扰载体的构建 张亚军，王成章，严学兵，樊文娜，杜红旗 (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002) 摘要：苜蓿(Medicagosativa)的秋眠性是一种光周期效应。研究植物体内重要的光受体——光敏色素A 干扰(RNA 性较低区域设计特异性引物，并引入相应的酶切位点，利用RT-PCR克隆phyA正、反向片段，经过3次亚克隆， 构建了phyA的RNAi表达载体，制备了适合转染植物组织的农杆菌菌液，为获得缺失phyA植株创超了条件。 关键词：紫花菖蓿：phyA：RNAi：载体构建 sativa day 紫花苜蓿(MedicagoL)为长日照植物(10ngplant，LDP)，在夏末和秋季日照长度逐 渐变短时表现出植株生长速度下降、茎枝匍匐生长等特性，即为苜蓿的秋眠。陛(fall dormancy，FD) 【11。该特性与苜蓿的生产性能直接相关，许多国家栽培苜蓿时已把秋眠性作为选择其品种时的首 要指标。但是由于苜蓿的秋眠性和抗寒性正相关，因此在苜蓿的秋眠性被发现以来的近一个世纪， 大多数科学家把研究重点放在与抗寒性有关的物质代谢上，致使其机理一直不清，苜蓿秋眠性在 生产上的应用有较大的局限性。 苜蓿在晚春和夏季长日下利于其生长发育，而夏末和秋季短日下休眠，说明苜蓿秋眠存在着 光周期效应【21。光敏色素是光周期反应的受体，参与光信息的接受和传递，光敏色素A 长日植物(LDP)诱导的光周期有关，并且phyA可以抑制某些生物合成，phyA突变体的转基因植物 光周期的敏感性有所下降【310对拟南芥和水稻开花光周期的研究，发现phyA介导对远红光的反应， 推测其可能是光周期反应中起主要作用的光受体基因【41。王成章【5】等研究了3个不同秋眠型苜蓿在 不同光周期条件下叶片和顶芽中phyB的含量，结果表明，和非秋眠苜蓿相比，秋眠苜蓿叶片中 phyB含量高，推测其作为绿色植物主要光受体可能通过光周期调控或参与了苜蓿的秋眠，phyA， phyB确实存在互作效应【6l’由此推测phyA在调控苜蓿秋眠性上可能也发挥了重要作用。但是迄 今为止尚未见有人研究phyA与苜蓿秋眠性之间的联系。 RNAi技术自发现以来，以其高效性、特异性及稳定遗传的特点，成为研究植物基因功能的 strands 重要手段。该技术是通过导入双链RNA(doubleRNA，dsRNA)，特异性地降解相应序列的靶 mRNA，从而阻断相应基因的表达，在植物中．构建合适的载体是应用RNAi的关键。本研究根 据RNAi技术的原理克隆phyA片段，构建其对应的RNAi表达载体，为特异性阻断该基因表达， 得到缺失phyA无秋眠表型的植株和确定该基因在苜蓿秋眠性中的功能奠定了基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1植物材料 SativaL．)品种佛纳尔“Vernal”为实验材料，该品种 选取实验室盆栽的紫花苜蓿(Medicago 为秋眠2级(fall class2，FD2)。 dormancy 1．1．2质粒和菌株 提供。克隆载体PGEM-T easy、大肠杆菌菌株DH5a感受态细胞和农杆菌菌株EHAl05分别购自 Promega公司、QIAGEN公司和北京鼎国生物技术有限责任公司。 1．1．2酶和试剂 Plus、 总RNA提取试剂RNAisoRT-RCR试剂盒、凝胶回收试剂盒、T4DNA连接酶和限制 性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司iPCRMasterMix、质粒小提试剂盒和DNA分子量 标准购自QIAGEN公司；其他常规试剂为国外或国产分析纯。 1．2方法 1．2．1目的片段的选取 Premier软件对其进行酶切位点分析，选取的目的片段上 选取目的片段：首先利用Oligo和Primer 的酶切位点，应与载体上用到的酶切位点不同，然后在NCBI网页上进行Blastn比对，排除与苜 蓿其他基冈同源性高的片段