广州地区汉族儿童群体肿瘤坏死因子βNcoI 位点多态性与全身反应综合征易感性的相关分析.docVIP

广州地区汉族儿童群体肿瘤坏死因子βNcoI 位点多态性与全身反应综合征易感性的相关分析 　　【摘要】目的 探讨TNFβNcoI位点多态性在广州地区汉族儿童中的分布特征,及与全身反应综合征的易感关系。方法 对481名广州汉族儿童健康个体及136例全身反应综合征患儿, 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法( PCR-RFLP) 对TNFβNcoI位点进行基因水平多态性分析。结果 广州地区汉族儿童群体TNFβNcoI位点有TNFB1/ TNFB1、TNFB1 /TNFB2、TNFB2/TNFB2 3种基因型,健康群体频率分别为24.74%、49.69%和25.57%，TNFB1等位基因分布频率较欧美白种人高，差异有统计学意义（P0.05）；全身反应综合征患儿等位基因频率为：18.38%，49.27%，32.35%，与健康群体组分布差异无统计学意义（(X2=0.98,P = 0.32 ).；该多态位点也不是SIRS的危险因子[OR= 0.75, 95% CI= (0.43-1.32)]。两群体样本分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。结论 广州地区汉族人群TNFβNcoI位点多态性普遍存在，基因型分布特征与白种人存在差异。样本为H-W平衡群体, 该等位基因多态位点与全身炎症反应综合征易感性无关。 　　【关键词】肿瘤坏死因子β；全身炎症反应综合征；多态性，单核苷酸；PCR-RFLP, 易感性,儿童 　　全身炎症反应综合征( systemic inflammatory response syndrome, SIRS)是因各种感染或非感染病因作用于机体而引起的一种难以控制的全身性瀑布式炎症反应[1]。肿瘤坏死因子β (tumor necrosis factor，TNFβ)作为前炎症因子，在炎症性疾病的发生发展中具有重要意义。研究此多态性在我国健康人群及全身炎症反应综合征（SIRS）群体中的分布特征有助于了解TNFβ与SIRS易感性的关系，全身性炎症反应的发病遗传背景，为炎性疾病在分子水平研讨发病机制奠定基础。本研究以广州汉族儿童个体为代表, 抽样调查了TNFβNcoI位点多态性在健康人群及SIRS群体中的分布状况, 探讨其分布特性及与SIRS的易感性关系；并进行Hard-Weiberg平衡检验。 　　1. 对象和方法 　　1. 1 对象样本分别来自广州地区481名学龄前健康儿童体检血标本及2013年1月-6月我院136例SIRS患儿血标本。SIRS诊断依据2005年国际儿科脓毒症定义会议上制定的SIRS诊断标准，为疾病组：男性89名, 女性47名。年龄在1月-13岁间，平均年龄（35.95±3.24）月；健康组：男性295名, 女性186名。年龄在1月-14岁间,平均年龄(49.97±0.99)月；排除炎症性疾病, 体格检查及检验未见异常。所有对象均为汉族儿童, 无血缘关系。2组儿童年龄（X2=1.784 / p= 0.218）、性别（X2=0.77/p=0.38）具有可比性。本研究实施过程符合医学伦理规范要求。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 外周全血基因组DNA的提取抽取受试者空腹外周静脉血1.0mL加抗凝剂EDTA 0.2～0.5mL 混匀抗凝,按QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany) 的操做指南进行外周全血基因组DNA提取;并将抽取的DNA样本标志好后于-20℃冰箱保存供后续实验使用. 　　1.2.2 肿瘤坏死因子βNcoI位点基因型测定：(1)扩增TNFβ基因片段:上游引物[7]5’-CCG TGC TrC GTG CTT TGG ACT A-3’，下游引物 5’- AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3’；PCR反应体系: Green master mix, 2×, (Promega，Madison ,USA)25μL, 上下游引物均为1.0μmol/L ,模板300～400mg,最后加纯水补至50. 0μL；按95℃预变性5 min ,然后94℃ 30s ,50 ℃ 60s ,72 ℃ 2min,共37个循环,最后72 ℃延伸5 min。扩增产物片段长度为872bp。(2)酶切反应：酶切体系: PCR 产物5μL, 10x酶切缓冲液2L, NcoI0.5U, 加水至20L,37℃恒温水浴2h,65℃15-20min终止反应。（3）确定基因型：取(10-15)μL酶切产物于20g/L 琼脂糖凝胶(0.5mg/ LEtBr)在EPS-300电泳仪(稳压稳流电泳仪，上海天能科技有限公司）中电泳(80～90V,1h ),以 DL 2000DNAMarker为分子量标准。将凝胶放置Gel Doc EQ凝胶成像系统(B