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人血白蛋白生产工艺及质量控制 中国药品生物制品检定所血液制品室 沈琦 蛋白质分离方法(1) 利用蛋白质溶解度 -盐析法 -有机溶剂沉淀法 -疏水层析法 -冻融法 -等电点沉淀法 蛋白质分离方法(2) 根据蛋白质分子大小、形状、密度 -凝胶过滤层析法 -过滤和超过滤 -离心和超离心 -透析法 蛋白质分离方法(3) 根据蛋白质带电性 -离子交换层析法 -制备电泳法 -固相聚电解质 利用蛋白质的立体结构中特定位点与配体的特异亲和力 -亲和层析法 蛋白质分离方法(4) 其他方法 -利凡诺、聚乙二醇、辛酸、硫酸铝钾、三氯化铝、硅藻土、活性碳、硫酸钡等 分离纯化要求 保留天然理化和生物学性质 避免和排除病原微生物及其代谢产物的污染 工艺适合工业化生产,低消耗,高产出 从血浆中可同时分离出多种蛋白质,综合利用 低温乙醇工艺分离蛋白原理 显著降低蛋白质水溶液的介电常数,增加蛋白质自身及它们之间的静电引力的相互作用 乙醇具有较低的介电常数 介电常数大,蛋白质溶解度大 介电常数低,蛋白质溶解度低 五变因素(1) pH: -当蛋白质分子含有相等的正负电荷时(即等电点)有最小的溶解度 -白蛋白等电点pH4.7-4.8 -IgG等电点pH5.8-7.3 -低温乙醇法pH4.4-7.4 五变因素(2) 温度: -整个过程0- -8℃ -温度降低使蛋白质溶解度降低,温度控制不好,轻则影响回收,重则造成蛋白质完全变性 -组分II沉淀高于要求1.3 ℃,产量降低37% -高于要求3.6 ℃ ,蛋白质完全变性 五变因素(3) 蛋白质浓度: -分离过程作适当稀释降低蛋白质浓度,减少蛋白质之间的相互作用,避免蛋白共沉 -过分稀释,蛋白质易变性 -增大分离容量,不可取 五变因素(4) 离子强度: -在低盐浓度条件下,盐浓度的不大改变可引起蛋白溶解度的很大的变化,盐类与蛋白质相互影响随离子强度而变化 -离子强度和乙醇浓度之间控制一种审慎的平衡关系,在一定范围内保持一种蛋白溶解度的恒定 -溶液的离子强度不能测量,可以计算 五变因素(5) 乙醇浓度: -乙醇能降低蛋白质的介电常数,随乙醇浓度增加,蛋白质的介电常数逐渐降低,而其溶解度急剧下降 -乙醇浓度每提高10%,白蛋白溶解度约以10倍的幅度下降 -乙醇浓度和pH变化最为重要 五变因素变动范围 白蛋白生产工艺(1) 白蛋白生产工艺(2) 各组分中蛋白分布情况 低温乙醇法优点 相对简单的操作,产量高,适宜工业化规模生产 保持蛋白质的天然特性 抑菌作用 同时分离多种血浆成分,适于血浆综合利用 乙醇作为主要原材料,价格低廉,易于获得 人血白蛋白原液检定 蛋白质含量 纯度 pH 残余乙醇含量 可在半产品中做 人血白蛋白半成品检定 1、热原检查采用内毒素方法，判定标准： 5%Pr：＜0.5 EU/ml 10%Pr：＜0.83 EU/ml 20%Pr：＜1.67 EU/ml 25%Pr：＜2.08 EU/ml 2 、无菌检查 病毒灭活工艺 制造过程病原体（病毒）灭活和去除 血浆蛋白纯化 -去除不需要的蛋白质 -去除潜在的病毒污染 -纯化步骤 乙醇沉淀 乙醇/PEG沉淀 层析/免疫亲和层析 纳米膜过滤 SH与中检所蛋白含量的趋势图 HD与中检所多聚体的趋势图 批签发-1 品种 -人血白蛋白 2002年试行 2003年正式试行 批签发-2 中国药品生物制品检定所-全国 吉林省药品检验所-山东、辽宁、黑龙江、吉林 北京市药品检验所-北京、河北、河南、山西 上海市药品检验所-上海、江苏、浙江、江西 湖北省药品检验所-湖北、湖南、安徽 四川省药品检验所-四川、重庆、贵州 甘肃省药品检验所-甘肃、新疆