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茶多酚抑制人高转移肺癌细胞增殖的机理研究 安 舟 周建英 浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科（310003） 茶多酚是茶叶中儿茶素类、黄酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称，其重要的成分是黄烷醇 类等多种儿茶素。茶多酚对癌症具有良好的化学预防和抑制作用。有关茶多酚抑制肺癌细胞增殖的 研究文献报道甚少，本实验采用MTT法和流式细胞术，体外观察茶多酚对高转移性人肺癌细胞的杀 伤作用及对细胞增殖周期、细胞表面CD151、CD44和CD82分子表达的影响，进一步探讨其作用机制。 1．材料和方法 1.1 药物及试剂 茶多酚（由中国茶叶研究所提供）CD151、CD44、CD82 鼠抗人抗体（BD Pharmingen 公司）。 1.2 细胞来源及培养 PG （人肺癌细胞株）由浙江大学生物医学工程系提供。含10%胎牛血清DMEM 培养基培养PG 、KB 细胞（贴壁生长），置于CO 孵箱中，在37℃，5% CO 及饱和湿度条件下培养。 2 2 细胞培养至对数生长期传代或用于实验。 1.3 实验分组 单纯PG细胞组（空白对照组）；茶多酚1组（200µg/ml ）；茶多酚2组（100µg/ml）；茶 多酚3组（50µg/ml ）；茶多酚4组（25µg/ml ）。 1.4 茶多酚体外抗肿瘤模型制作 用细胞消化液消化贴壁细胞，用含10%胎牛血清DMEM 培养基终 4 止消化。将细胞用 10%胎牛血清DMEM 培养基配成单个细胞悬液，以每孔 10 个细胞接种于96 孔 板中，按不同设计浓度加入不同量的茶多酚溶液，每孔终体积 200µl （不足体积用含10%胎牛血清 DMEM 培养基补齐）。将培养板移入CO2 孵箱中在37℃，5% CO2 及饱和湿度条件下培养，定期显 微镜下观察细胞生长状态。 1.5 四唑盐（MTT ）比色试验 显微镜下观察96孔培养板中细胞密度有明显变化时进行MTT 比色试 验。吸净96孔培养板中上清，用PBS配制成5mg/ml MTT溶液，每孔加入20 µlMTT溶液，孵育4小时 后取出，每孔加入DMSO 150µl ，轻微震荡培养板后上酶标仪（测量波长480nm ，参考波长630nm ） 读取数据（OD值）。按下列公式求出生长抑制率进行评价。 生长抑制率(%)=(1-用药组平均OD值／对照组平均OD值)x100% 1.6 细胞周期测定 采用美国BeckmanCoulter公司的二倍体标准品作为正常二倍体对照，用EPICS XL型流式细胞仪（美国Coulter公司）测定组织细胞中G /G 期、S期和G M期细胞占总体细胞的百分 0 1 2 数计算细胞周期各时相比例，以下列公式计算增殖指数（PI ）： PI=(S+G ／M) ／(G ／G +S+G ／M) ×100% 2 0 1 2 1.7 CD151、CD44、CD82 和fas 荧光水平测定 分别加入PE 结合小鼠抗人CD151、CD44、CD82 单抗20µl 、生理盐水200µl ，摇匀后室温下避光反应30min，再加入生理盐水 1ml，1500r/min 离心 5min，弃上清液后加入2%多聚甲醛500µl 固定。后用流式细胞仪测定CD151、CD44、CD82 荧光水 246 平。 1.8 统计学处理分析 以上每次实验重复5次，采用SPSS 10.0软件包处理数据，计量资料用x±s表示， 显著性检验采用t检验。 2 ．结果 2.1 茶多酚对PG细胞杀伤活性的测定和对PG细胞增殖周期的影响 上述4个浓度的茶多酚对PG细胞 均有杀伤活性，25µg/ml 即可表现出一定的杀伤力，且随药物浓度的增加，作用加强（表1）。 表1 MTT 试验中茶多酚对PG 细胞吸光值的影响 分组 MTT值 P值 杀伤率 对照组