食线虫细菌侵染线虫分子机制研究.pdfVIP

2007年中国微生物学会学术年会 179 新疆胀果甘草内生茵的分离和鉴定 宋素琴欧提库尔-玛合木提张志东 唐琦勇 (新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐，830091) 对采自新疆的健康野生胀果甘草不同组织中的内生菌进行分离，确立了分离的条 件为5％NaCIO。浸5分钟，分离纯化得到149株细菌和2种真菌。通过形态学观察和 革兰氏染色，细菌中芽孢杆菌为93株，56株杆状菌，使用法国梅里埃细菌自动鉴定仪 对其进行鉴定，得到鉴定结果的细菌属于13个属，真菌显微形态鉴定属于Penicillium 青霉菌属和Fusarium镰刀菌属。 食线虫细菌侵染线虫分子机制研究 黄晓玮 牛秋红 田宝玉廉立慧 张克勤 (云南省生物资源保护与利用重点实验室(省部共建国家重点实验室 培育基地)，云南大学云南省昆明市翠湖北路2号，650091) 植物寄生线虫具有地域分布广泛、宿主种类多样等特征，并容易使已发生线虫病害 的植物继发真菌或细菌感染，从而给农作物、林木和食用菌带来很大的危害。而我们现 今所依赖的化学防治，由于对环境的破坏以及对人畜安全性的影响，其使用正逐步受到 限制，因此生物防治病原线虫成了植物线虫病害综合治理研究的前言和热点。在线虫 侵染过程中，无论是对于虫体本身还是线虫虫卵来说，其覆盖于表面的体壁或卵壳都是 线虫防止侵染的重要保护结构，而蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助杀线虫生物完成 侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子之一。但目前，侵染性蛋白酶在食线虫细菌中是 否起作用，以及哪些种类的侵染性蛋白酶涉及侵染过程都需要进一步研究。因此在食 线虫细菌的研究中，纯化、鉴定新的可降解线虫体壁的侵染性蛋白酶，并进行基因克隆 180 2007年中国微生物学会学术年会 及其深人系统的功能研究，不仅能进一步完善食线虫细菌侵染线虫的分子机理，并可促 进线虫生防研究向基因工程方向发展，为线虫生防菌的遗传改良及将侵染性蛋白酶基 因转人农作物构建培育出抗性品种奠定重要基础。 本研究首先开展杀线虫细菌资源调查，筛选获得一株对线虫具有强侵染作用的食 nematocida 线虫芽胞杆菌B16菌株(BacillusB16)，其保存号为No．CGMCCll28。对该 菌株侵染线虫过程中所参与的毒力因子分析发现，侵染性胞外蛋白酶是该菌株最主要 的致病因子。我们通过硫酸铵分级沉淀、蛋白质液相层析等方法对参与侵染过程的蛋 白酶进行了分离纯化，最终获得了具有侵染作用、且性质截然不同的两种胞外蛋白酶。 我们将得到的电泳纯的目标蛋白酶经过电转移到PVDF膜上并送到中国医学科学研究 院基础医学研究所进行N一末端氨基酸检测，然后把N一末端氨基酸检测结果在NCBI 上检索，发现它们和来源于淀粉液化芽孢杆菌B．amyloliquefaciens的碱性丝氨酸蛋白 酶subtilisin 以提取食线虫芽胞杆菌的基因组DNA为模板，并针对以上比对结果设计的简并引物， 进行PCR扩增克隆得到了相应的目的基因。胞外侵染性碱性丝氨酸蛋白酶的编码基 146 bp开放性阅读框架，共编码382个氨基酸残基。其中 因全长1163bp，包含一个1 包括30个氨基酸残基的信号肽，77个氨基酸残基的前肽，275个氨基酸残基的成熟肽， 该基因提交GenBank，序列号为：AY708655。胞外侵染性中性蛋白酶基因的开放性阅 读框架全长1566个碱基，编码一个521个氨基酸残基的蛋白质，其中含有27个氨基酸 残基的信号肽，194个氨基酸残基的前肽，成熟肽具有300个氨基酸残基，该基因登记 708654。 GeneBank，接受号为AY 为进一步系统研究两种蛋白酶在线虫侵染过程中的作用，我们采用pET30载体系 统在大肠杆菌BL21中蛋白酶进行了成功异源表达。异源表达的重组蛋白酶与来自野 生型的蛋白酶具有相似的生化特性，并且将重组表达的碱性丝氨酸蛋白酶和中性蛋白 酶分别作用于受试活体线虫，均可以观察到它们的杀线虫活性。其中以碱性丝氨酸蛋 白酶作用线虫Panagrellusredivius60小时后，观察到90％以上的线虫死亡，且大多数死 亡线虫体壁降解，而用作阴性对照的磷酸盐缓冲溶液PBS处理受试线虫相同时间后