抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定.pdfVIP

解剖学研究2011年第33卷第2期 AnatRes，2011，Vo1．33．No．2 105 · 论 著 抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的 制备及鉴定 陈易斐， 黄莉钧， 李 磊 ， 戴智育， 程 锐， 杨 霞 ， 高国全 (中山大学中山医学院生物化学教研室，广东广州510080) 摘【要】 目的 激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein—bindingprotein，KBP)具有抑制血管新生的高活性。但 目前尚无KBP 的特异性抗体，限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法 构建含 大鼠源性 KBP序列的pET．28a重组载体的大肠杆菌 BL21(DE3)，在此基础上 ，扩增表达菌 ，经异丙基 B．D一硫代半乳糖 苷 (IPTG)诱导表达 ，Ni．NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用 SDSPAGE和 Westernblot方法对 KBP进行鉴 定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大 白兔，获得兔抗 KBP血清 。亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western．blot方法 检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达，且纯度大于85％。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗 KBP抗体 ，效价达 1：512000，并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋 白。结论 以纯化的KBP重组蛋 白为抗原 ，获 得 KBP多克隆抗体 ，具有较好的效价和特异性 ，为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。 【关键词】KBP重组蛋白； 多克隆抗体制备； 抗体评价 Preparationandpurificationofrabbitanti-KBPpolyclonalantibody CHENYi-fei，HUANGLi-jun，LILei，DAIZhi—yu， CHENGRui，YANGXia，GA0Guo—quart．DepartmentofBiochemistryMolecularBiology，ZhongshanMedicalSchool，SUN Yat—senUniversity，Guangzhou510080，China A【bstract】 Objective KBP，shortfromkallikreinbindingprotein，isaendogenousproteinwithhighantiangiogenic potentia1．ThefurtherstudyaboutKBP iSrestrictedbecausethereiSstillnotspecificanti．KBP antibody． ThisstudyiSdesignedto obtain highlysensitiveand specificanti—KBP polyclonalantibody and ealTy on theprimary evaluation ofit． Methods Th e expressionvectorpET28a—KBPhadbeenreconstructedandtransformedintoBL21(DE3)byOUrlab．RecombinantKBPproteinwas inducedtoexpressbyIPTG andpurifiedbyNi—NTA HisBindresin． PurifiedKBPwasidentifiedbySDSandwesternblot analysisandusedtoimmunizetheNew Zealandrabbits． Th eanti—KBPpolyclonalantibodyispreparedbyaffinitypurificationfrom therabbits’serum afterimmunization．Th etiteroftheantibodywasdetectedbyELISA anditsspecificitywasanalyzedbyWestern blot． Results Th eKBPrecombinantproteinwashighlyexp