紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力.docVIP

紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力 ????作者：冯健雯(梧州市产品质量监督检验所,梧州543002)　　样品用磷酸盐?半胱氨酸?ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后,选择一定的ｐＨ值和温度条件,样品中的木瓜蛋白酶能将加入的酪蛋白水解生成可溶解的氨基酸,末水解的酪蛋白用三氯乙酸沉淀后过滤,溶解的水解产物用紫外吸光光度法测定[1]。1　试验部分1.1　试剂与仪器????磷酸钠溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,称取十二水磷酸氢二钠1.79ｇ溶解于100ｍｌ水中。????柠檬酸溶液:0.05ｍｏｌ·Ｌ-1,将柠檬酸一水合物1.05ｇ用100ｍｌ水溶解。????缓冲溶液:称取十二水磷酸氢二钠17.89ｇ溶于800ｍｌ水中,再将ＥＤＴＡ钠盐二水合物14.0ｇ和盐酸半胱氨酸一水合物6.1ｇ溶于其中。用1ｍｏｌ·Ｌ-1盐酸或1ｍｏｌ·Ｌ-1氢氧化钠将ｐＨ值调到6.0±0.1,加水定容至1Ｌ。????三氯乙酸溶液:将三氯乙酸30ｇ溶于100ｍｌ水中????酪蛋白作用物:将1ｇ干燥的酪蛋白分散在50ｍｌ磷酸钠溶液中,在沸水浴中加热30ｍｉｎ,经常搅拌之,冷至室温,在连续快速的搅拌下,用柠檬酸溶液调ｐＨ值至6.0±0.1,加水定容至100ｍｌ。????标准溶液:1ｍｇ·ｍｌ-1,称取ＵＳＰ木瓜蛋白酶对照标准物100ｍｇ(其活力为100ＰＵ·ｍｇ-1),用磷酸盐?半胱氨酸?ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解,定容100ｍｌ。????标准使用液:移取0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ｍｌ标准溶液于一组10ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。????酸度计:分度值0.1ｐＨ,ｐＨ6.0±0.1。????超级恒温水浴:40±0.1℃????紫外分光光度计:波长200～1000ｎｍ?1.2　测定方法1.2.1　样品处理????称取样品1.00～2.00ｇ,加磷酸盐?半胱氨酸?ＥＤＴＡ缓冲溶液搅拌溶解后转移至50ｍｌ容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。1.2.2　测定????取一组25ｍｍ×150ｍｍ的试管(14支),分别移入酪蛋白作用物5ｍｌ(其中6支制作标准曲线,1支制作样品,7支制作酶和样品空白)。将所有试管于40±0.1℃水中恒温20ｍｉｎ后,迅速向其中7支试管移入上述各标准使用液和样品处理液2ｍｌ(此标准系列的浓度分别为0.025,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25ｍｇ·ｍｌ-1),在旋转混合时开始记时,盖好塞后放入水浴,60ｍｉｎ后,向所有试管加入三氯乙酸溶液3ｍｌ,立即旋转混合,在空白管中分别移入各标准使用液和样品液2ｍｌ,将各试管放回水浴,加热30ｍｉｎ使沉淀蛋白质全部凝结,用定性滤纸过滤,弃去开始2ｍｌ滤液,用紫外分光光度计,在1ｃｍ石英比色皿中,于波长280ｎｍ处,对照相应的空白,测定标准和样品(滤液)的吸光度,绘制标准曲线比较。1.2.3　计算????木瓜蛋白酶单位,其定义为在检测条件下,每1ｈ释放出相当于1μｇ泰乐菌素的酶量,一个木瓜蛋白酶单位简称1ＰＵ。????酶活力(ＥＡ)[2]以木瓜蛋白酶单位数/ｇ(ＰＵ·ｇ-1)表示,按下式计算:????????????ＥＡ=(Ａ·Ｃ×50)/ｍS式中　Ａ———ＵＳＰ木瓜蛋白酶的活性,ＰＵ·ｍｇ-1??????Ｃ———从标准曲线上求得的样品处理液浓度,ｍｇ·ｍｌ-1??????ｍS———样品质量,g??????50———样品定容的体积,ｍｌ2　结果与讨论2.1　吸收光谱????取一定量的ＵＳＰ木瓜蛋白酶标准物,按试验方法操作,在200～320ｎｍ范围内绘制吸收光谱曲线,见图1。最大吸收波长在280ｎｍ处,选此波长作为测定波长。2.2　试验条件的选择2.2.1　介质的选择????试验发现,木瓜蛋白酶不完全溶于水,且几乎不溶于多数有机溶剂,选择磷酸盐?半胱氨酸?ＥＤＴＡ缓冲溶液溶解较完全,成均匀溶液。2.2.2　酸度与温度的选择????试验在ｐＨ5.5～7.0的酸度中进行,发现在ｐＨ6.0～6.5范围内,温度40℃时,酪蛋白作用物水解完全,吸光度最大且稳定,选ｐＨ6.0,温度40℃为测定条件。2.3　标准曲线????用1ｍｇ·ｍｌ-1的酶标准溶液配制标准系列,按试验方法进行测定,并绘制标准曲线,其回归方程为ΔＡ=-0.012+3.08Ｃ(ｍｇ·ｍｌ-1),相关系数ｒ=0.998,测定木瓜蛋白酶的线性范围为0～0.25ｍｇ·ｍｌ-1。2.4　分析结果与回收试验????取远东美容保健用品有限公司(香港远东索芙集团有限公司)生产的索芙特木瓜系列护肤品做样品分析与回收试验,结果见表1。参考文献:[1]　李泰森