实验五胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响.docVIP

实验六 胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 实验五 葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2004 专业、层次：临床医学本科 　　　　　　 授课教师：汪宗桂 职称：助教 　　　　　　学时：3学时 基本教材：自编 《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求： 1、观察胰岛素和肾上腺素对家兔血糖浓度的影响。 2、掌握血糖浓度的测定方法。 3、掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理和方法。 4、掌握血糖浓度的正常参考值，了解血糖测定的临床意义。 大体内容与时间安排： 1、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的原理 5min 2、胰岛素和肾上腺素对血糖浓度影响的注意事项 5min 3、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理 5min 4、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的操作改动及注意事项 5min 5、学生做实验 100min 教学方法：讲授式+启发式 教学重点、难点： 重点：1、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理 2、葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项 难点：葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的注意事项 一、实验原理 （一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 激素是调节机体血糖浓度的重要因素。胰岛素能降低血糖，肾上腺素等激素能升高血糖。 本实验给两只家兔分别注射胰岛素或肾上腺素，取注射前、后兔的静脉血，测定血糖含量，观察注射前后血糖浓度变化，从而了解胰岛素和肾上腺素对血糖浓度的影响。 （二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 本实验是葡萄糖氧化酶 (GOD)和过氧化物酶 (POD) 相偶联发生的偶联反应。 第一步：葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。 第二步：过氧化物酶在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原 性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物(苯醌亚胺非那腙)。 二、操作步骤 （一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 1、动物准备：取正常家兔两只，实验前预先饥饿16小时，称体重(—般为2-3kg)。 2、注射激素前取血：—般多从耳缘静脉取血：剪去耳毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，于放血部位涂一薄层凡士林，再用粗针头或刀片刺破静脉放血。采用葡萄糖氧化酶—过氧化物酶法时，则将静脉血收集于干净试管中,静置至血清析出。取血完毕，用干棉球压迫血管止血. 3、注射激素：—只兔子注射胰岛素；皮下注射，剂量为0.75U/kg体重。另一只兔子注射肾上腺素：皮下注射，剂量为0.4mg/kg体重。分别记录注射时间。 4、注射激素后取血：方法同上；取血时间：肾上腺素注射后30分钟；胰岛素注射后1小时。从注射胰岛素的兔子取血后，应立即用10ml 250g/L葡萄糖做腹腔内或皮下注射，以防家兔发生胰岛素休克(低血糖休克)。 5、测定血糖：分别测定各血样的糖含量，方法请见实验四“血糖测定”。 6、计算：计算注射胰岛素后血糖降低和注射肾上腺素后血糖增高的百分率： △BS=注射后BS—注射前BS；“+”值表示BS升高；“—”值表示BS降低(BS—血糖)。 （二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 1、取试管3支，按下表操作。 葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 － － 0.01 葡萄糖标准应用液 － 0.01 － 蒸馏水 0.01 － － 酶酚混合试剂 1.5 1.5 1.5 混匀，置37℃水浴中，保温15min，加2ml水混合后在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。 2、计算： 三、注意事项 （一）胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响 1、剃兔耳毛时，先用水润湿后在剃毛，要求耳缘静脉四周要剃干净，否则取血时易引起溶血； 2、选用腹部皮肤作胰岛素和肾上腺素皮下注射 ，一手轻轻提起腹部皮肤，另一手持注射器以45°进针，针头不要刺入腹腔，更不要穿破皮肤注射到体外。 （二）葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 1、最后加酶酚混合试剂，各管反应时间应一致； 2、因用血量甚微，操作中应直接加样本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠； 3、葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量； 4、严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。 四、思考题 葡萄糖氧化酶法不能直接测定尿液葡萄糖含量；而且严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。为什么？ 小 结 葡萄糖氧化