奶牛子宫内膜粘液抗菌肽分离纯化.pdfVIP

中国奶业协会第24次繁殖学术年会簧国家奶牛／肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会论文集 奶牛子宫内膜粘液抗菌肽的分离纯化· 严作廷1，米宝明1’2，宗瑞谦2，祝秉东3，王桂荣2，李世宏1，王东升1 (1．中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050；2．甘肃农业大学动物医 学院，甘肃兰州 730070；3．兰州大学基础医学院，甘肃兰州730030) 摘要：研究目的：为研发奶牛抗菌肽生物制剂，防治奶牛子宫内膜炎疾病。研究方法：采用酸性尿素聚 丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法检测子宫内膜粘液酸溶性提取物抗菌活性：应用琼脂糖电泳及水平电泳洗 电泳检测其分子量。研究结果：从奶牛子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一分子量约为14KD左右的抗菌多 内膜分泌的抗菌多肽，参与了奶牛子宫的天然防御机制。 关键词：子宫内膜：抗菌肽；分离纯化 抗茵肽(Antimicrobial peptide)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，也称肽类 菌肽具有分子质量小，热稳定、水溶性好以及广谱抗菌等特点【2】。随着人们研究工作的深入开展，发现有 些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，且不破坏动物及人体正常的体细 胞。由于其在动物组织中含量很低，目前对抗茵肽的研究主要集中在分离纯化新的抗菌多肽分子和基因工 程技术生产重组蛋白。 本研究针对奶牛业生产实际需要，参考国际抗菌肽最新研究成果】。实验通过酸性尿素聚丙稀酰胺电 泳洗脱技术和反相高效液相色谱技术，分离纯化奶牛子宫粘液内源性抗菌肽，并检测其抗菌活性，为从奶 牛子宫粘液分离并鉴定新的内源性抗茵多肽提供基础，也必将推动奶牛子宫内膜疾病的防治研究。 1材料和方法 1．1试剂 Phenylmethanesulfonyl 为Sigma产品。大豆培养基为sigma产品。其他试剂为国产分析纯。 1．2奶牛子宫粘液粗提物的制备 奶牛子宫内膜粘液来自三例产奶量下降且不怀孕的奶牛。将新鲜牛子宫剔去外容物，剖开，一边用双 蒸水冲洗一边用剪刀刮取内膜粘液将其置于50mL的离心管(在低温下操作)，立即加人等量的5％乙酸 含蛋白酶抑制剂(含PMSF，1．,eupeptin，Pepstatin)，样品经10000rpm离心20min弃除沉淀。上清液置 于3500Da的透析带中，4C透析48h。冷冻干燥，保存于．80℃备用。 1．3奶牛子宫粘液酸溶性提取物电泳分析及抗菌活性分析 基金项目：中央级科研单位基本科研业务费项目资助(B砌’070305) 中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛／内牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会论文集 251 浓度为12．5％，胶厚0．75ram。凝胶于150 AU—PAGE电泳分离后，对称切割，一半考马斯亮蓝R250染色以显示蛋白条带，观察蛋白有七条主条带。 另～半用于检测抗菌活性【51’电泳凝胶用10MmoL／L 涤后的电泳凝胶置于底层琼脂上，37C孵育3h。让电泳凝胶中的蛋白质分子充分向琼脂中弥散，取出电泳 凝胶。在底层琼脂上覆盖一层2×营养琼脂(1％琼脂糖，6％大豆培养基)。倒置37C过夜孵育。测量琼脂 上抗菌条带迁徙率，与染色电泳凝胶蛋白条带迁徙率相比较，以确定具有抗菌活性的条带。 1．4制备性AU—PAGE分离 取奶牛子宫粘液酸溶性提取物，按Pmyim方法作制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，切割下具有抗 用。 1．5反相高效液相色谱分离 nm，流速lmL／min，收 分离条件【6】：0．01％--氟乙酸_÷60％乙腈0-60rain线性梯度洗脱，检测波长214 集洗脱液lmL／管，冷冻干燥，溶于0．0l％乙酸待做活性检测。 1．6子宫粘液酸溶性提取物抗菌多肽分子量测定 测定抗菌多肽的相对分子质量。胶 将冻干的样品参照schagger等[7】的方法行Trici鹏．SDS电泳， 浓度16．5％，3％C，胶厚lmm，60V电泳3hE右，考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。 1．7多肽的抗菌活性鉴定 倒入 医学院结核