雷公藤活血化瘀作用的分子生物学机制的研究.pdfVIP

·卯‘ 第六次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会 014 雷公藤活血化瘀作用的分子生物学机制研究 杜金行1 川合真一2 史载祥1 1、中日友好医院中医心肾科(北京，100029)2、日本圣玛利亚医科大学 雷公藤始载于《中国药植志》，苦涩、寒、有毒。功能舒筋活血、祛风除湿，近年来被广泛应 用于类风湿性关节炎、肾病等各种自身免疫性疾患。为了探讨雷公藤的活血化瘀、抗炎作用，我们 B(IL．1 采用白介素一1 B)刺激的慢性类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞，观察了雷公藤提取 物雷公藤多甙(GTw)对滑膜细胞产生的炎症因子前列腺素Ez影响。 材料与方法 一．药物 l、观察药：将GTW(江苏泰州制药厂提供)原粉制备成lOmg／rnl的乙醇溶液，离心后将上清 it 液用00．45m滤过灭菌，．20℃保存备用。阳性对照药物为消炎痛(Ind、SIGMACHEMICACO)，地塞 米松(Dex、和光纯药工业株式会社)。 2、试剂IL．1B为genzyme公司产品、花生四烯酸(从)与PGE：ELISA 药盒采用Cayman公司产品，RPMll640为日研生物研究所制，其它为和光纯药工业株式会社制。 二．方法 1．细胞的分离与培养：诊断符合美国风湿病学会拟定的典型或肯定的RA标准，在行关节置 换手术时探取滑膜组织，用O．2％胶原酶处理90分钟后，分离洗净细胞，悬浮于含10％的血清及抗 菌素的RPMI培养液中，37℃、5％C02下传代培养。将贴壁细胞做为滑膜细胞使用。 2．PGE2含量测定：在48孔平底微型塑料培养板的各孔中加入200pl细胞悬液(5×104个细 B，同时加入GTW、Ind、Dex或乙醇， 胞)，培养24小时后洗净，然后加入终浓度为lng／ml的IL．1 u 用RPMI洗净后，加入终浓度为3M的从，放置30分钟后离心，用ELISA药盒测定培养上清液中的 PGEz含量。 3．GTW毒性的检测：与测定PGE2含量一样，培养滑膜细胞中加 入实验药物，采用Cell Counting(同仁化学研究所)进行了观察。同时对药物作用后的细胞，采用 锥虫蓝染色，观察了细胞的死亡情况。 4．Western IL．1 Blotting Analysis：将传代培养后的滑膜细胞参照文献，加入终浓度为lng／ml 13或GTW+IL一1 13，回收细胞测定上清液中蛋白质含量，电泳后转染于多聚偏氯乙烯纤维膜，采用 抗体法Western Blotting ．2(COX．2)影响。 5．Northern IL．1 BlottingAnalysis：将传代培养后的滑膜细胞参照文献，加入终浓度为lng／ml 13或GTW+IL．113，培养6小时后采用ISOGEN RNA提取试剂，提取总RNA，电泳后转染，以32P标记 的COX一2 mRNA。 eDNA为探针，杂交后洗净，用X线读取；同样将转染膜除去探针后，检出COX一1 结 果 1．GTW对IL．1B刺激的RA滑膜细胞分泌PGE。的作用) GTW对IL-l 13刺激的RA滑膜细胞具有抑制其分泌PGE：的作用，作用特点与Dex相似，随剂 lI 量的增大而加强。GTWlOmg／ml时抑制强度最大，为60．74-5．5％，IC50为7．1±1．3g／ml。