9204微生物鉴定指导原则.pdfVIP

9204 微生物鉴定指导原则 本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节，药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关，未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户 1 应明确所采用鉴定系统的局限性及所要达到的鉴定水平(属、种、菌株)，选用最 适合要求的鉴定技术。 1、待检菌的分离纯化 微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化，最常用的分离纯化方法是挑 取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化，以获取待检菌的纯培养物 （单个菌落）必要时可进一步进行纯培养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足 够量菌体。从药物原材料、制药用水、及生产环境、中间产物和终产品的样品中 检出的受损微生物，经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态转变为在 营养富集和最佳培养温度条件下生存的稳定状态，以保证鉴定结果准确性。 2、初筛试验 常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征， 将待检菌做初步分类。常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色 结果和细胞形态、重要的生化反应等。 重要的生化筛选试验包括： 氧化酶试验 用于区分不发酵的革兰阴性杆菌(氧化酶阳性)和肠道菌(氧化 酶阴性)。 过氧化氢酶试验 用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性)和链球菌(过氧化氢 酶阴性)。 凝固酶试验 用于区分凝固酶阴性葡萄球菌 (可推测为非致病性)和凝固酶 阳性葡萄球菌(很可能为致病性)。 初筛试验可将大部分的细菌鉴定到属的水平，这些试验可为某些评估提供充 足的信息。对于微生物鉴定方法来说，初筛试验是最关键的一步，若给出了错误 的结果，将影响后续试验，包括微生物鉴定试剂盒和引物的选用， 3、表型微生物鉴定 表型微生物鉴定依据基因物质的表达来区分不同微生物间的差异，是经典的 微生物分类鉴定法，以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生 物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物细胞的差异的进行鉴别。 微生物分类中使用的表型特征见表1。 2