C型肉毒毒素的制备及类毒保护力初探.pdfVIP

判定C6514产生的肉毒毒素毒力(LDsdml)。 4种子扩大培养 5毒素扩大培养 将种子扩大培养物接种于含CM培养基的大立瓶中(9000ml／瓶)，小心振荡混匀，35℃厌氧培养4 天。 6肉毒毒素的纯化㈨p’ 6．1除菌过滤 10min。上清倒人装有EKS板的滤器中加压过滤除菌。 将大立瓶中的产毒培养物离心：6000rpm 6．2硫酸铵盐析 将过滤除菌后的肉毒毒素加饱和硫酸铵或固体硫酸铵，使毒素中硫酸铵的饱和度达到60％。4。C静 置2天。 6．3离心 NaCl的0．05MAB(PH4．0)稀释沉淀，并_l贝4 将盐析后的毒素10000rpm离心10min。用适量含O．2M 定上清和沉淀的毒力。 6．4透析 将稀释下来的沉淀毒素装入透析袋，于40C在o．05MAB中透析2天，其间换液2～3次。 6．5鱼精蛋白处理 测分光，根据透析物的量按1毫升透析物加0．00069鱼精蛋白的比例加入鱼精蛋白，振荡2h，再 6000rpm离心10min，收集上清。 6．6 650M(TOSOH)离子交换层析 SP—Toyopearl 1)上样量：根据柱体积与样品蛋白浓度确定上样量，使每100ml层析介质上样蛋白浓度控制在 100N120mg。 2)洗脱与收集：流速12滴／分钟，上样后以0．2～0．8MNaCl梯度洗脱，收集第二峰。 7纯化毒素的鉴定陋”刖 7．1 SDS—PAGE 用4％浓缩胶与12．5％的分离胶，选用SDS低分子量Marker。在样品缓冲液和聚丙烯酰胺中加入去 污剂(SDS)和还原剂(DTF)，根据样品蛋白浓度，确定样品与样品缓冲液的比例，沸水浴7分钟后上 样，120V电泳1小时，用考马斯亮蓝染色。 7．2纯化毒素的特性鉴定 7．2．1毒力测定 另设一组对照，注射等量GPB，根据动物死亡情况，判定毒力(LDsdml)。 7．2．2蛋白含量测定 测定0D280，计算纯化毒素的蛋白含量。 7．3毒素的型特异性鉴定 7．3．1中和试验反应法 取肉毒毒素专用诊断血清，包括A、B、C、D、E、F型及混合型肉毒抗血清各1支，按说明书操 作步骤及试验范例设计定型试验，每组各注射小鼠4只，每只o．5ml，96小时内观察。根据小鼠死亡 情况判定肉毒毒素型别。 。 7．3．2免疫双扩法 用l％琼脂，采用微量法：用梅花打孑L器j：T：fL，中间孔加纯化的C型肉毒前体毒素，周围6孔分别 加A、B、C、D、E、F型诊断血清。加入样品后，置湿盒内于370(2放置24小时，玻片取出用生理盐水 充分洗涤后，用氨基黑染色。 7．3．3 Western blotting鉴定 按常规Western blotting步骤操作，一抗为C型肉毒诊断血清，酶标记的二抗为驴抗绵羊IgG，工作 浓度为l：200。 8 c型肉毒类毒素的制备 8．1肉毒毒素的脱毒 采用分段脱毒法，按毒素的量每次加福尔马林0．2％，保持37。C，每次间隔一周。共三次， 8．2脱毒检查㈣1 X 将脱毒后类毒素稀释至10ug／ml约1 射后观察一周，另注射小鼠10只，14—169，每只注射0．5ml，观察一周。 9 C型肉毒类毒素保护力实验 9．1佐剂 佐剂为A1(OH)，，Al(OH)，含量为1％，NaCl含量为0．85％，PH6．5。 9．2试验组设计 佐剂。根据免疫次数的不同，又分为A1、Bl、Cl、Dl和A2、B2、C2、D2组。 9．3免疫 C2、D2组注射2针，两针间隔2l天。 9．4标毒 将C型肉毒毒素以不同梯度稀释后注射对照组小鼠，以小鼠半数死亡稀释组的毒素标定为1LD，。， 再以此为标准标定出50LD，。毒素。 9．5攻毒 于第二针免疫后第15天，以同样方法将对照组D2及实验组A2、B2、C2攻毒。于攻毒后4天内观察结 果。 10小鼠抗血清保护力的测定晒1 将脱毒后的类毒素与弗氏不完全佐剂混合配制成免疫用抗原，使其类毒素