MG-S6株MGA0553基因的功能研究初探.pdfVIP

其他论文 性核酸内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定有无插入片段及片段大小。 酶切结束后将产物用1％琼脂塘凝胶进行60v恒压电泳1．5h，在凝胶成像分析系统下观 察并拍照记录。 1．4MGA05∞的原核表达 1．4．1重组质粒在E∞盯BL21(DE3)中诱导表达条件的优化 mM mM 似昀ct、0．4％Gl”eml、17KH2P04、72K2HP04)培养基中，37℃、200rpm振荡培 Ih、2ll、3h、4h、5h、6h的菌液各lmL待用；同时设立空载体诱导对照组。． 两次彻底去除培养基成分。最后以50uLPBS重悬菌体，加入50uL2×上样缓冲液(O．5M pH 6．8Tris．HCl2mL、甘油2mL、20％SDs2mL、溴酚蓝0．5InL、2-巯基乙醇1mL、去离子水 2．5mL)。充分悬浮混匀，煮沸3min，12000rpm离心15min，吸取上清进行sDs电 100uL、10％过硫酸胺100¨L、TEMED6皿，5％浓缩胶：去离子水3．75mL、30％丙烯酰胺 lm、O．5M pH6．8硼州c11．5mL、10％sDs60皿、lO％过硫酸胺60皿、TEM匣D5皿)．80v 恒压电泳，特溴酚蓝跑至底线时停此电泳：取下凝胶，放入考马斯亮蓝R250(50％甲醇、 10％乙酸、0．2％考马斯亮蓝R250)染色3小时，用脱色液(10％乙酸、5％乙醇)脱色过夜， 其间换脱色液20次；蛋白凝胶成像系统上扫描分析。观察产量，进行表达量的优化。 1．4．2原核表达产物的可溶性分析 将lOmL上述经表达优化的诱导菌液】2000rpm离心5min，弃上清，称量沉淀质量，并 用PBS(pH7．2)洗涤细菌3次．最后用约4倍于沉淀质量的PBS重悬菌体，超声波裂解 (40W×lO秒，间隔8秒，工作循环60次)，取少量涂片草酸铵结晶紫染色镜检，破碎完全 后12000rpmxl5miII离心，分别收获上清和沉淀，等量上样．进行SDS．PAGE电泳，经染 色、脱色后观察上清和细胞沉淀MGA0553表达产物的含量。 1．5小鼠多抗的制备和检测 根据实验结果，将表达产物的包涵体用PBs重复洗涤3次，加入等量的2×上样缓冲液． 经SDS．P^GE电泳分离后，切下能够表达重组菌的阳性条带，磨碎后以适量的PBS混匀， 腹腔及皮下多点注射免疫6周龄IcR小鼠(本院比较医学中心提供)。按常规免疫程序作基 础免疫(10天／次)，并加强免疫3次。于最后一次免疫后10天行摘除眼球法采血．分离血 清． 利用切胶免疫制各的高免血清和抗GsT多抗．对MGA0553基因的原核表达产物进行 用APoIID公司的电泳仪进行SDS．队GE电泳，电泳条件为：浓缩胶电压60v．分离胶电 压90v，待溴酚蓝到底部停此电泳；取下凝胶，一面经考马斯亮蓝R250染色，乙醇．乙酸脱 色液脱色，观察结果；另一面凝胶用转印缓冲液(甘氢酸2．99，Tds-B∞e5．89，sDs0．379， 取出Nc膜，置封闭液(1×TBs，5％脱脂奶粉)中4℃封闭过夜，然后置于5mL含多抗(用 TBs O．0lM DAB．5mL 一次；在5mLDAB显色液(0．5mg 中进行避光显色lo-30min，水洗后终止反应，拍照记录。 1．6生长抑制试验 取处于对数生长期中期的s6株培养物5mL，以12000rpm高速离心lO分钟，去上清， 用改良F托y‘s完全液体培养基悬浮洗涤两次，最后以lmL培养基重悬沉淀：将重悬菌液作 10倍系列梯度稀释，取1矿．1 0．”稀释的菌液涂布改良Frey‘s完全固体培养基作细菌平板计 数，每个梯度接种3个平板，每个平板接种0．4mL，37℃、lO％c02下培养3天，将平板上 1092 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二】欠学术研讨会 的菌落记数，计算原重悬菌液中菌体含量(取几何平均数)，根据平板计数结果将琢菌液稀 后作lO倍系列梯度稀释，进行平扳计数，同时设立鼠抗S6全菌血清阳性对照和非免阴性血 清对照。根据计数结果比较分析菌体生长前后及不同组别间细差异．计算生长率． 1．7用wbtern-bIot方法检测MG的相关蛋白 1．7．1用表达产物抗血清捡溯MG的膜蛋白