外源性骨髓间充质干细胞参与角膜上皮愈合.pdfVIP

外源性骨髓间充质干细胞参与角膜上皮愈合1 1,2 2,3 1,2 1,2 许传超 ，刘祖国 ，张慧 ，梁凌毅 1 中山大学中山眼科中心，广州（510275 ） 2 中山大学眼表疾病研究中心，广州（510275 ） 3 厦门大学医学院眼科研究所，厦门（361005 ） E-mail ：zuguol@ 摘 要：目的 探讨利用骨髓间充质干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症的可行性；方法 体外培 养扩增人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs），并利用 BrdU 对其进行标记；将标记后的 hBMMSCs 注入兔角膜上皮缺损模型的角膜缘基质层内。观察动物模型上皮痊愈过程中 hBMMSCs在角膜 上皮迁移分化的过程；结果 hBMMSCs 可随着角膜上皮愈合的过程从角膜缘区域迁移到角膜 中央上皮，并分布到全层，表现出与角膜上皮细胞相似的形态分布。角膜上皮细胞特异分化 标志 K3 的检测亦为阳性。结论：hBMMSCs 可参与到角膜上皮损伤的愈合过程，并具有分化 为角膜上皮细胞的潜能。 关键词：骨髓间充质干细胞；角膜上皮细胞；创伤愈合；分化 由于各种疾病和损伤所致角膜缘干细胞功能障碍，最终会导致角膜上皮功能障碍，甚至 发展成角膜盲。恢复角膜缘干细胞的数量和功能是治疗此类疾病的关键。目前多采用异体角 膜缘移植[1,2]，但供体来源不足以及异体移植不可避免的免疫排斥反应均制约了这种方法的 疗效。组织工程技术及干细胞研究为克服这些缺点带来了希望。成年人骨髓中存在着多向分 化潜能的间充质干细胞（BMMSCs ），在体外实验中，BMMSCs 可被定向诱导成脂肪细胞、 [3,4] [5] [6] 软骨细胞 、神经细胞 、甚至胰岛素分泌细胞 等。但对于BMMSCs 能否分化为角膜上 皮细胞仍未有成功的报道。在此我们初步观察BMMSCs 对单纯角膜上皮损失修复的影响， 为进一步利用BMMSCs 作为替代细胞治疗角膜缘干细胞功能障碍及构建组织工程化角膜作 实验准备。 1. 材料和方法 1.1 试剂 DMEM-LG （Gibco ）；DMEM/F12 （Gibco ）；胎牛血清（FCS ，Gibco ）；胰蛋白酶（Amerson ）； 淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque 1.077g/ml ，上海华精）；mouse anti-human keratin 3/12 (chemicon)；Cy3-sheep anti mouse IgG (Sigma)；5-Bromo-2-deoxy-uridine (BrdU，Roche) ； mouse anti BrdU (Roche); Hoechst 33342 (invitrogen) 。 1.2 方法 1.2.1 hMSCs 分离和体外扩增 健康成年肋骨来自外科手术中舍弃的标本。PBS 彻底冲洗骨表面的血迹后，用无菌注射 器吸取无血清的 DMEM-LG 培养液反复多次抽吸、冲洗骨髓腔，最;;;后将骨髓细胞悬液常 规离心后弃去表面的脂肪层和上清，再次用 PBS 重悬，用密度梯度离心法分离单个核细胞 层，DMEM 培养液洗涤、离心 3 次，最后用含 10％FCS 的 DMEM-LG 重悬和计数，以 2×105cells/cm2 的密度种植，置于37℃含体积分数5 ％CO 及饱和湿度环境中培养，72h 后全 2 量换液，尽量去除悬液和细胞碎片，之后每隔3 －5 天换液一次，倒置相差显微镜下观察细 1本课题得到高等学校博士点专项科研基金(20040558076)及国家自然科学基金广东省科技计划 项目重大专项（2003A3020106 ）的资助。 - 1 -