利用Ion+Torrent半导体离子测序技术快速检测假肥大型肌营养不良症的基因突变.pdfVIP

首届中国遗传与疾病论坛——常见与罕见神经遗传病规范化诊治学术交流会 学术论文 下一代测序技术(NGS)的迅速发展，为临床检测提供了可靠的新方法。Roche公司的 测序技术诞生，它的技术优势是传统的SaIlger测序法无可比拟的，不仅保持了高准确度， 而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。NGS各平台一次测序可产生几百Mb 甚至lGb以上，高准确度、高覆盖度。目前NGS在生命科学领域广泛应用，包括测序、表 观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面，并起到了极大的推动作用，将人们真正带到 了高通量的测序时代【8】。进行临床检测时，其测序时间、样本规模以及检测成本仍是需要考 虑的因素。综合评估NGS各大平台的技术特点【9】，IonPGM测序仪的设计是基于半导体芯 片技术，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT。Ionto玎ent半导体离 子测序技术耗时短，成本低，通量高，能够在3小时内，产生从10Mb到lGb以上的高精 确度序列【lo】。本实验室选用Iont0仃ent测序平台对假肥大型肌营养不良症的致病基因DMD 基因进行深度测序，再与参考序列进行比对，找出致病根源，为其家族的遗传咨询提供了有 用的信息。 假肥大型肌营养不良症是最常见的一类进行性肌营养不良症，X一连锁隐性遗传病，发 BMD的产生也是由于DMD基因突变所致，通常突变后产生的DMD蛋白仍具有一定功能， 临床症状较DMD轻得多，BMD的发病率是DMD的1／10【11，12】。主要是男孩发病，女性为 致病基因的携带者。通常5岁左右发病，肌萎缩呈进行性，预后差。有约l／3病例为散发， 没有家族史，是由基因新突变造成。DMD基因定位于xp21．2上，DNA全长2．4Mb，共有 79个外显子，78个内含子，其cDNA全长为13974 bp，编码的肽链含3685氨基酸残基， 编码427KD的细胞骨架蛋白——抗肌萎缩蛋白(dys仃．ophine)。 DⅧ基因突变的形式多样，主要是缺失突变、重复突变、微小突变。针对不同的突变 类型，可利用不同的手段来检测，主要包括MLPA、基因测序、连锁分析。DMD基因突变 约65％为基因缺失，重复突变约占7～10％，微小突变占25～30％。对于BMD患者中，缺失 突变约占85％，重复突变约占6～10％，微小突变占5～10％。 材料与方法 1研究对象 7例假肥大型肌营养不良症家系，先证者均为男性，年龄为2个月～13岁。先证者的诊 断主要依据假肥大型肌营养不良症的临床症状，突出表现为骨盘带肌肉无力，典型鸭步，上 70 首届中国遗传与疾病论坛——常见与罕见神经遗传病规范化诊治学术交流会 学术论文 楼及蹲位站立困难，腰椎前凸，出现Gower症，实验室检测均发现肌酸磷酸肌酶(CPK) 活性升高。 2研究方法 2．1DNA提取 采集受检者的外周血31111，应用商品化试剂盒提取总gDNA，试剂盒提取方法步骤参照 使用说明，取适量gDNA进行紫外分光光度计检测浓度和纯度，其余gDNA保存于．20℃。 2．2MLPA检测 SALSA P034和P035两组。将gDNA变性，再与SALSAMLPA探针杂交，然后用Ligase-65 连接探针，再进行探针PCR、毛细电泳。由于有内标作为参照，每个峰都可以代表一个外 显子，每次Ⅶ，PA检测都包括一个正常的对照样本。 2．3Iontorrent高通量测序 MLPA方法检测为阴性，可通过基因测序方法对基因的微小突变进行检测。本研究中采 用Ionton．ent PGM高通量测序平台进行DMD全外显子测序。 2．3．1 DNA建库 Disease to玎cnt提供的111h耐ted 使DNA浓度约3ng／ul。采用Ion PaIlel和Ion加npliseq州 2．0扩增目的基因，加上接头序列，纯化。 Libr哪Ⅺt 2．3．2油包水PCR和富集 OneTouclllM200 v2试 将建库后的DNA定量