探索适当的诊断策略%3a使用表皮生长因子受体基因突变特异性抗体检测非小细胞肺癌中EGFR突变状态.pdfVIP

为止，尚没有任何一种阳性判定标准为大家所公认，阻碍了突变特异性抗体检测EGFR突变 在临床的推广使用。 我们本次研究采用四级评分法并结合阳性细胞所占范围的评分方法，对比分析了经分子 检测的399例NsCLC标本中EGFR突变的结果，探讨了应用该法筛查非小细胞肺癌标本EGFR 突变的可能性。 二、材料和方法 1．病例选择及分子检测：收集中国医科大学病理科从2008年8月至2012年8月经 PCR Taq№n 145例，穿刺活检标本220例和细胞学标本34例)。患者的年龄从26岁至89岁(年龄中位 数为62岁)；214个男性患者，185个女性患者；341例肺腺癌，47例肺鳞癌，11例其他类 型。手术切除和穿刺标本经4％中性甲醛固定后，石蜡包埋制成蜡块，胸腔积液标本先经离 心去除上清，再经4％中性甲醛固定后制成石蜡包埋块。所有石蜡标本均分别切成8岬厚度， DNAMicro 使用QIA锄p kit(Qiagen公司)提取和纯化石蜡包埋组织或细胞学样本中基因组 Medical 个突变位点的引物及TaqMan探针均购买于GP real—time PCR仪(AppliedBiosystems公司)。 2．免疫组织化学染色：将制作好的4um厚度组织或细胞包埋切片经二甲苯及梯度乙醇 9．o，DAKO公司)在水浴 中进行常规脱蜡和水化处理。使用EDTA抗原修复液(1衄ol／L，pH 锅中进行抗原修复20min。使用过氧化物酶封闭液(DJfIl【0公司)室温孵育15Ⅲin封闭内源性 过氧化物酶活性，非免疫羊血清室温孵育15min封闭非特异位点，一抗使用总EGFR单克隆 的EGFR突变特异性单克隆抗体(3种抗体均购自Cell SignalingTechnology公司)，用PBS ENvISl0N Kit，DAI(O公司)室温孵育30min后，DAB液(DAK0公司)显色，最后用苏木精对 比染色、脱水、封片。 3．免疫组织化学染色评分：评分标准，是以肿瘤细胞的膜和(或)质着色强度和阳性 细胞所占切片内的范围来决定的，分为O，1+，2+，3十四个等级。完全无着色为0分；淡黄 染无明显颗粒状着色或黄染明显颗粒状着色但范围小于10％时为1+；黄染明显颗粒状着色范 围大于10％或棕褐色颗粒状着色但范围小于10％时为2+；棕褐色颗粒状着色范围大于10％时 定义为3+。穿刺和细胞学标本则以5个以上肿瘤细胞组成的细胞团的着色情况为准。所有 的免疫组织化学染色评分结果均是由三位有经验的病理医师(刘洋、于涓瀚和张勇)在未知 患者临床状态及病理诊断的情况下的一致评定。 4．统计分析：以分子检测结果为参考计算免疫组织化学检测结果的敏感度、特异度、阳 性预测率(PPV)及阴性预测率(N1)V)。使用cohenK评估两种检测方法的一致性。统计分析 13．0for 均使用SPSs windoWs(SPss公司)完成。 110 三、结果 PcR 1。分子检测399例NScLc样本中EGFR突变：采用TaqMan assay方法检测399例 35．29％(12／34)。 2．突变特异性EGFR抗体免疫组织化学检测与分子检测结果的比对分析：在399例NSCLC 以3+为阳性时筛选EGFR突变可以获得很好的特异度和PPv(均为100％)，而以O分为阴性 时筛选EGFR突变可以获得较好的NPV为93．15％。使用cohenK评估了不同阳性判定标准 下分子检测和免疫组织化学检测结果的一致性。当以0和1+为阴性，2+和3+为阳性时，两 假阴性，而2+的病例中存在33例(32．04％，33／103)假阳性，导致突变特异性抗体检测的 (D3881)并不是突变特异性抗体，它识别的是总EGFR蛋白而与其突变状态无关。尽管总EGFR 在绝大多数病例中均为高表达，但仍然存在38例1+和27例0分的病例，其中12例经分子 检测明确存