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日期： 年 月 日 2012 10 19 创造由化学合成基因组控制的细菌细胞 年 月 日，美国科学杂志上有一篇研究论文名为“创造由化学合成基因组控 2010 5 20 制的细菌细胞”，其内容摘要为：克雷格·文特尔私人研究机构从基因测序信息数据化开始， 报道含有1,080,000 个碱基对的蕈状支原体JCVI-syn1.0 基因组的绘制、合成和组装，并且 把它移植进一个山羊支原体受体细胞中，创造一个仅仅由（化学）合成的染色体组控制的 新的蕈状支原体细胞。该细胞中，唯一的 DNA 就是那有计划合成的DNA 序列，包含“水 印”序列和其他在构建过程中所需的基因删除、多态性和变异。 背景： 作者表示，此前科学界对基因组，尤其是基因组的功能，知之甚少。自从1977 年桑格 （Sanger）及其同事确定了噬菌体φX174 的完整基因密码，即世上第一个DNA 基因组完整 测序成功以来，生物基因组的测序成果呈指数型增长，从而产生了数不清的基因组信息数 据。然而，即使一个单细胞系统的基因及其对应生物功能都还没有搞清楚。因此，作者提 出了一个研究思路：在简单的单细胞生物细菌中，染色体是否已经包含正常生命活动所需 的全部指令？如果真是这样的话，能否将计算机中的基因组序列用化学合成的方法得到一 个能够复制的完整基因系统？ 整个团队用了 年时间，致力于人工合成 大分子和染色体，并用来构建一个最 15 DNA 小的只是包含必需基因的细胞。他们选用的含有已知生物中最小基因组的单细胞生物—— 生殖支原体，它的485 个编码蛋白质的基因中有超过一百个不是必要的。他们最终得到了 “由化学合成基因组控制的细菌细胞”。然而，他们的研究并不是一帆风顺的。 在当时，人工化学合成只能得到平均 大小的 片段，如何将这些小片段组装起 6kb DNA 来得到DNA 大分子呢？他们研究得到一种方法：将化学合成的全部 DNA 小片段导入酵母 菌中利用同源重组拼接成大片段，多次进行最终得到完整的基因组。其中，还需利用大肠 杆菌扩增、筛选。 然而，将化学合成的基因组移植进受体细胞并成功表达也有不少的障碍。例如，如何 完整地从酵母菌中提取出染色体？如何将合成的基因组移植进受体细胞，并且建立一个仅 由外来基因组控制的细胞？而且，生殖支原体的生长速率及其缓慢。研究团队重新选择了 生长比较快的蕈状支原体作为基因组供体，山羊支原体作为人工合成的基因组受体作进一 步研究。 尽管克服了上述困难，在移植蕈状支原体天然DNA 的时候，他们成功地得到了完全由 蕈状支原体基因组控制的山羊支原体，但为什么改用化学合成的蕈状支原体基因组会导致 失败呢？ 研究继续进行，他们最后发现蕈状支原体和山羊支原体共用一套“抵御系统”，天然的 蕈状支原体基因组已经被甲基化，能够使该基因组被山羊支原体接受。因此，化学合成且 在酵母菌中拼接而成的基因组需经过甲基化酶修饰。 研究结果最终证明，在简单的单细胞细菌中，染色体上有其正常生命活动所需的全部 指令信息。 主要研究结果： 实验步骤简单概括为如下 个方面： 4 1 合成供体的基因组DNA： 首先，将蕈状支原体的全基因组测序，并按照该序列信息将其合成为 1 078 条平均长 度为1 080bp 的DNA 片段。这些片段两两间具有80bp 的部分重叠，所有片段拼接起来构 成蕈状支原体的全长基因组。值得注意的是这些合成的片段较天然基因组略有一些改动， 包括去除了 个不重要的基因、为阻断基因而设计的两个插入序列、 处单核苷酸多态 14 27 性 其中 处在意料之中 以及 条用来区分于天然序列模本的“水印”标记 ，这些改 19 4 动都不影响细胞正常的生命活动。该过程涉及到计算机对合成序列的精密计算。 2 合成DNA 片段的拼接： 将以上合成的1 078 条DNA 片段分别连接到载体，使其能在酵母细胞中通过同源重 组拼接起来。于是，平均 的 片段， 个一组拼接为大约 的片段 1 080bp DNA 10 10 kb 109 个，然后将这些连接有目的基因片段的载体从酵母中分离出来，转入大肠杆菌 中进 E. coli 行扩增，以限制酶筛选出阳性克隆；之后再将阳性克隆质粒中的这109 条10 kb 左右的片 段按同样的方法每组 个拼接成 的片段 个；这 条片段最终拼接成完整的 10 100 kb 11 11 总共 的基因组 由于携带太大片段的载体在 中不能稳定传代，因此后 1 077 947bp E. coli 两步拼接中采用多重 来筛选阳性克隆 。此过程除了 个衔接反应是在体外用酶处理 PCR 2 构建，其余所有的片段都是在酵母细胞内依靠同源重组拼接而成。 3