β-榄香烯联合DC%2fDRibble疫苗促进脾细胞增值及活化的研究.pdfVIP

许多研究表明中药及其有效成分具有免疫调节活性,能够增强免疫活性细胞 的功能。ß-榄香烯是从姜科植物莪术中提取的抗癌有效成分，有研究表明ß-榄香 烯能够增强肿瘤细胞的免疫原性，诱发和促进对肿瘤细胞的免疫反应，提高荷瘤 [1] 机体细胞免疫功能 。DC 是目前发现的体内最强的抗原递呈细胞 （antigen-presenting ，APC ）。自噬小体(Dribble)，是肿瘤细胞“递交”肿瘤抗原的 有效载体之一，APC 交叉递呈源自自噬小体抗原，并诱导细胞免疫应答的效果明 [2] 显强于灭活肿瘤细胞和可溶性蛋白 。前期实验已经证明 ß-榄香烯可以增强 DC 表面多种免疫相关的共刺激因子的表达，更有利于DC 呈递外源性抗原以及激活 [3] T 细胞，使机体更好的发挥免疫监视和免疫应答 。本实验通过观察ß-榄香烯联 合DC/DRibble 疫苗对小鼠脾细胞活化增殖作用和对IFN-? 分泌水平的影响，为进 一步研究ß-榄香烯抗肿瘤的免疫机制提供依据。 1 材料和方法 1.1 动物与试剂 小鼠 BNL1MEA.7R.1(简称 BNL)肝癌细胞株由东南大学免疫实验室常规冻存； Balb/c 雌性小鼠， 6-8 周龄，购自扬州大学实验动物中心，清洁级培养；ß-榄香 烯注射液购自大连华立金港药业有限公司，批号为 0904281 ；Flt3-L 和 GM-CSF 真核表达质粒由东南大学免疫实验室常规冻存；RPMI-1640 培养基购自Invitrogen 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品研究所；红细胞裂解液购自碧云天生物 试剂公司；流式检测用荧光标记抗体CD11c-PE，CD11b-FITC 购自美国 BD 公司； 小鼠细胞因子IFN-?ELISA 检测试剂盒购自美国 RD 公司； CCK-8 试剂盒购自江 苏碧云天公司；蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物有限公司。 1.2 树突状细胞及DRibble 的制备 脾脏来源的 DC 制备按文献 4 的方法，采用尾静脉快速注射法，获得脾细胞 悬液，用流式细胞法检测DC 含量 （后文中提及DC 均为诱导后脾细胞悬液）。 小鼠皮下接种体外传代培养BNL 肝癌细胞，取瘤细胞于500ml 细胞培养瓶中 培养，参考文献2 方法，提取细胞上清中的DRibble，保存于-20℃，避免反复冻 融，以Bradford 法测定DRibble 中总蛋白的含量。 1.3ß-榄香烯联合DC 疫苗体外诱导脾细胞增殖 取冻存的DC 细胞复苏，加入制备好的Dribble，37℃恒温培养箱培养6 小时。 取出后用 PBS 缓冲液洗涤两次，加入培养液重悬，制备成 DC/DRibble 疫苗，调 整细胞浓度，置于冰上备用。取健康Balb/c 小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，细胞 计数调整到适当浓度。 实验分四组：A. 1640 培养液组；B .DRibble 刺激组；C.DC 刺激组；D. DC/DRibble 6 疫苗刺激组。将健康小鼠脾细胞接种于96 孔板中，调整脾细胞浓度为1×10 /ml 。 5 5 A 组加 1×10 /ml 脾细胞，B 组加 Dribble2ug/孔+1×10 /ml 脾细胞，C 组 加入未 5 5 和Dribble 孵育过的DC1×10 /ml ，D 组加入DC/DRibble 疫苗1×10 /ml 。各组加入 不同浓度的ß-榄香烯0、4 、10、40 （ug/ml ），终体积100ul/孔，各浓度设4 个 复孔，孵育72 小时，每孔加入CCK-8 溶液10ul ，继续培养2 小时，于490nm 处 用酶标仪测定各孔吸光度 （A ）值，仅加入CCK-8 作为调零孔，不加任何刺激因 素孔作为阴性对照孔。计算脾细胞增殖率=