白术内酯Ⅰ、Ⅱ对TNF-α所致炎症因子的影响.pdfVIP

倒置显微镜 （日本Olympus 公司） 2 、方法 2.1 溶液配制 细胞培养液：体积分数为10%的新生胎牛血清，90%的DMEM ；MTT 溶液：MTT 0.5g，37℃水浴溶于0.01mmol/L，pH 7.4 的PBS 100ml 中，浓度为5mg/ml，过 滤除菌，小量分装，避光保存于4 ℃中；白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、施维舒溶液： 取适量，分别以DMSO 溶解成10g ·L- 1 ，存储于-20 ℃，用时依需要稀释；TNF- α溶液：按说明书溶解成20ng/ul 2.2 细胞培养 GES- 1 细胞培养液为含 10%新生胎牛血清的 DMDM 培养液中，在 CO2 培养箱 （37℃,5%CO ）中培养 ；每天换液，至80%左右融合时，0.25%胰酶消化传代， 2 2 天传代一次，传代3 次后的细胞用于实验。 2.3 实验分组 将处于对数生长期的细胞随机分为4 组 空白对照组：细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基 单纯 TNF- α组：细胞中加入适当浓度的TNF- α溶液 药物预处理组：细胞中加入不同浓度的白术内酯 Ⅰ、白术内酯Ⅱ溶液预处理 8 小时，继以TNF- α刺激16 小时 阳性对照组：细胞中加入不同浓度的施维舒溶液预处理8 小时，继以TNF- α刺 激16 小时 2.4 白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、施维舒对GES- 1 细胞毒性试验 （MTT 法） 取对数生长的GES-1细胞消化后加入一定量的培养液,制成细胞悬浮液,接种于 3 96孔板中,接种密度为6×10个细胞/200μl/孔,置于CO培养箱中进行培 2 养;24H细胞贴壁后,弃去培养液,分别加入白术内酯Ⅰ（5,10,20,40ug/ml ）、白术 内酯Ⅱ （5,01,20,40ug/ml）、施维舒 （2.5,5,10,20,40ug/ml ）200μl继续培养，每 组浓度设三个复孔;48H后加入20μlMTT溶液继续培养4H,吸去全部培养液,加 入200μlDMSO溶液,在微型振荡器振荡10 min。酶标仪上测定光吸收,测定波 长为570nm。实验中另设不加细胞的空白对照组,以及只加细胞不加任何样品溶 液的阴性对照组。计算细胞存活率,计算公式为: 细胞存活率= ( OD实验组- OD空白组) / ( OD阴性对照组-OD空白组)×100%。 实验重复3次。 2.5 TNF- α浓度的选取 RT-PCR 法检测不同浓度TNF- α刺激后细胞内IL-4 ，IL-6，IL-8，COX-2 的表达 取对数生长期细胞，采用0.25%胰酶加上0.02%EDTA消化2分钟，800rmp离心5 分钟，用含10%胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，细胞接种于12孔板，接种密 4 度为10×10 个/2ml /孔，培养箱中培养24H，弃去上清，加入不同浓度的TNF- α （0.5,1,2,5ng/ml ）继续培养16H，并设空白对照组；根据Trizol 说明书提取细胞 RNA， 用紫外分光光度仪对所提取RNA进行纯度鉴定和定量,并按逆转录试剂 盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。目的 基因IL-4引物序列：上游引物：5 ′-CACAGGCACAAGCAGCTGAT- 3 ′，下游引物：5 ′ -CTCTGGTTCTTCCTTCACA- 3 ′；IL-6引物序列：上游引物：5′-CTTTTGGAGTTTGAGG TATACCTAG-3′下游引物：5 ′-CGCAGAATGAGATGAGTTGTC- 3 ′；IL-8引物序列：上 游引物：5 ′-TGCCAAGGAGTGCTAAAG- 3 ′，下游引物：5 ′-CTCCACAACCC TCTGCAC- 3 ′；COX-2引物序列：上游引物：5 ′-CAATCTGGCTGCGGGAACA CAACA - 3 ′下游引物：5 ′-ATCTGCCTGCTCTGGTCAATGGA- 3 ′；内参基 因GAPDH引物序列:上游引物:5′- GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3 ′;下游引 物: 5′- TTGATTTTGGAAGGATCTCG - 3 ′。反应程序为：95 ℃预变性90 s ,95 ℃ ( GAPDH) 退火5 s ,58 ℃延伸30 s ,共40 个循环,每个循环结束后采集 荧光信号。以G