β-榄香烯联合DC%2fDRibble疫苗治疗小鼠肝癌免疫机制研究.pdfVIP

[3] 疫应答 。本研究主要探讨 β-榄香烯联合 DC/DRibble 疫苗治疗小鼠肝癌的免疫 机制。 1 材料和方法 1.1 动物与试剂 小鼠 BNL 肝癌细胞株由东南大学免疫实验室冻存； Balb/c 雌性小鼠， 6-8 周龄，购自扬州大学实验动物中心，清洁级培养；β- 榄香烯购自大连华立金港 药业有限公司，批号为0904281 ；Flt3-L 和GM-CSF 真核表达质粒由东南大学免疫 实验室常规冻存；RPMI-1640 培养基购自 Invitrogen 公司；胎牛血清购自杭州四 季青生物制品研究所；红细胞裂解液购自碧云天生物试剂公司；流式检测用荧光 标记抗体 CD11c-PE，CD11b-FITC 购自美国 BD 公司；小鼠细胞因子 IFN- γELISA 检测试剂盒购自美国RD 公司；蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物有限公司。 1.2 树突状细胞的制备 Balb/c 小鼠脾脏来源的DC 制备按文献4 的方法，采用尾静脉快速注射Flt3-L、 GM-CSF 质粒法，获得包含大量DC 的脾细胞悬液 （后文中提及的DC 均为诱导后 的脾细胞悬液），留取部分脾细胞流式法检测DC 含量。 1.3 肝癌荷瘤鼠模型建立及DRibble 的制备 小鼠皮下接种体外传代培养 BNL 肝癌细胞，接种不同细胞数量，观察成瘤 情况。将肿瘤剥离取出，研磨，过滤，洗涤，用适量培养液重悬细胞，移入500ml 细胞培养瓶中培养，细胞贴壁生长，生长状态良好，参考文献 1 方法，提取细胞 上清中的DRibble，保存于-20℃，避免反复冻融，以Bradford 法测定DRibble 中 总蛋白的含量。 1.4 β-榄香烯联合DC/DRibble 疫苗对脾细胞分泌IFN- γ的影响 1.4.1 检测不同免疫方式对小鼠脾细胞分泌IFN- γ的影响 取冻存的DC 细胞复苏，加入制备好的DRibble，37℃恒温培养箱培养6 小时。 取出后用 PBS 缓冲液洗涤细胞两次，加入适当体积的培养液重悬，制备成 DC/DRibble 疫苗，调整细胞浓度，置于冰上备用。 采取不同方式免疫小鼠，分组如下：A.PBS 组;B. DC/DRibble 疫苗组;C. β-榄 香烯组；D. β-榄香烯联合 DC/DRibble 疫苗组。A 组皮下、腹腔注射 PBS；B 组 DC/DRibble 疫苗免疫，将Balb/c 小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式 麻醉，待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以无菌手术器械剪开小鼠腹部皮肤，找到 两侧腹股沟淋巴结，第1 天每侧淋巴结注射15ug DRibble，无菌手术缝线缝合伤 6 口，皮下两点注射DC/DRibble 疫苗，每侧5 ×10 个，分别在第3、5 天，双侧腹 股沟附近皮下注射DC/DRibble 疫苗，每侧5 ×106 个；C 组连续腹腔注射 β-榄香 烯7 天，剂量50mg/kg, ，D 组DC/DRibble 疫苗免疫同时腹腔注射 β-榄香烯7 天。 第10 天将小鼠处死，于75%乙醇中浸泡5min，无菌手术分别取出不同小鼠的脾 脏，制备单细胞悬液，用培养液重悬，调整至合适浓度，分别接种于24 孔板， 6 浓度为2 ×10 /ml ，每组分设不加刺激和Dribble 刺激，收集孵育72 小时的培养 上清，ELISA 法检测上清中IFN- γ的含量。 1.4.2 检测不同刺激方式对免疫后小鼠脾细胞分泌IFN- γ的影响 采用 β-榄香烯联合 DC/DRibble 疫苗免疫小鼠，免疫方式同上，第 10 天将 小鼠处死，于 75%乙醇中浸泡 5min，无菌手术取出小鼠的脾脏，制备单细胞悬 液，用培养液重悬，调整至合适浓度。 实验分四组：A. 培养液组；B .DRibble 刺激组；C.DC 刺激组；D. DC/DRibble 疫苗刺激组。将各组刺激与免疫后小鼠脾细胞共同培养于24 孔板中，每孔脾细 6 5 胞浓度为 2 ×10 /ml ，B 组 Dribble 5ug/孔，C 组 DC 浓度为 2 ×10