采用HepG2细胞模型评价BP0018线粒体毒性.pdfVIP

首届中国药物毒理学年会(2011年)暨国际药物非临床安全性评价研究论坛 采用HepG2细胞模型评价BP0018的线粒体毒性 龚立，曾文，中渝波，冯兴磊 (中国医药集团安全性评价研究中心，四川成都610052) BP0018是一种核苷酸逆转录酶抑制剂，具有抗病毒逆 pmol／L)，每个浓度组三个重复瓶。放入37℃、5％C02培 转录酶活性作用。其作用机制是代谢产物可模拟天然核苷结 养箱内再培养24h后移去药物，换为普通培养液；后期处 构，作为RNA病毒的逆转录酶或DNA病毒的DNA聚合酶理时，每3d换液一次，于第9天分别将细胞进行消化处理， 错配底物，竞争性作用于酶活性中心，嵌入正在合成的病毒 计数细胞数目。以溶媒组为对照，计算各药物浓度组细胞生 DNA链中，终止DNA链的延长，从而抑制病毒复制[1-31。长百分比。 临床上拟用于乙型肝炎的治疗。 细胞计数方法：台盼蓝染色法。抑制率折算方法：以溶 媒组为对照，对照组细胞数一给药组细胞数／对照组(细胞 核苷类药物的作用靶点是RNA病毒的逆转录酶或DNA 病毒的DNA聚合酶，因此也会与宿主细胞的DNA聚合酶数)X100％。 有一定的亲和力，对正常机体组织细胞产生副作用。这类药 1．3对HepG2细胞乳酸产生水平的影响 物引起催化产生ATP的线粒体酶合成减少，导致细胞功能 细胞处理同1．2。于第9天后收集细胞上清，-70℃冻 减退甚至坏死卜71，还可通过mtDNA突变或缺失、细胞内代存或直接用乳酸测定试剂盒进行测定；同时对细胞进行消 谢和氧化应激来影响线粒体功能18,9]。 化，采用台盼兰拒染法，对活／死细胞数进行计数：然后将 18的线粒体毒性进行了 结果换算成每106个细胞产生的乳酸量。比较不同浓度条件 本研究采用HepG2细胞对BP00 研究。通过测定细胞培养液中乳酸盐含量，细胞线粒体呼吸 下乳酸的产量。 链复合体活性变化、线粒体DNA含量变化、透射电镜观察 1．4对HepG2细胞线粒体结构的影响 线粒体形态结构的变化，同时与上市药物阿德福韦酯和齐多 细胞处理同1．2。于药物处理9d后收集细胞，取培养 000 细胞2～4mL，放于离心管中，用1500～2 r／min离心 夫定比较，综合评价BP0018对Sep02细胞产生的线粒体毒 性及其严重程度。 lO～15min，弃去上清液：用吸管沿管壁缓慢加入约0．5％戊 1材料与方法 二醛固定液(原液用PBS1：6稀释)，在4摄氏度环境中静 I．I细胞系和主要试剂 置15～30min；再用10000～13000r／min离心10b15rain， 人肝癌Hep02细胞株，购自中科院上海细胞生物学研弃去上清液；再用吸管沿管壁缓慢加入3％戊二醛固定液即 究所(批号：CCTCC，GDC024)。以含10％胎牛血清的可。样品经3％戊二醛预固定，1％四氧化锇再固定，丙酮逐 l强MIl640培养液，置37℃、5％C02培养箱中培养。BP0018，级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋 白色结晶性粉末，无臭，不溶于水，微溶于醇。齐多夫定 酸铀及枸橼酸铅双重染色，日立H—600Ⅳ犁透射电镜观察。 (Zidovudine，AZT)，上海现代制药股份有限公司生产。阿1．5对HepG2细胞线粒体呼吸链酶活性的影响 000 德福韦酯(Adefovir，ADV)，江苏正大天晴药业股份有限细胞处理同1．2。于药物处理第9天收集细胞，l 公