食用菌中产漆酶菌株的初步的研究--漆酶高产菌株筛选及漆酶基因片段的克隆.pdfVIP

JⅡF f上I，‘o儿ⅡI吐j¨AL儿J·扯‘iSj‘‘………… 食用菌中产漆酶菌株的初步研究 ～一漆酶高产菌株筛选及漆酶基因片段的克隆 任广明 李滇华 摘 要：研究利用不同底物浓度、不同培养时间、不同培养 基为优化因素，对漆酶产生菌株筛选条件进行了初步研究， 从广泛4株食用真菌中筛选具有高产漆酶特性的真菌，双孢 RT—PCR方法对漆酶基因进行扩增，克隆后得到长度为 {60bp的漆酶基因片段。 关键词：漆酶，RT．PCR，双孢菇2796 真菌是自然界中漆酶的主要来源之一，广泛存在于担子菌、半知 菌和子囊菌中，其中最主要的生产者是担子菌【14】。漆酶fLaeeases) 是一种含铜的多酚氧化酶，它与真菌的发育、形态发生过程相关，参 与孢子的产生。子实体酌形成等：漆酶具有广泛的底物作用范围，可 催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃[5-91：漆酶还 可以氧化木质素中的酚型单元形成苯氧自由基，从而导致木质素相关 结构的降解和转化：在合适的氧化还原介体存在时，漆酶还可催化氧 化非酚型的木质素模型化合物。可见，漆酶不仅在木素的生物降解和 制浆造纸中有重要应用前景，而且在废水处理、生物漂白、环境污染 物脱毒、土壤修复等方同样具有潜在的应用价值。 目前，研究者对漆酶产生菌株初筛条件的研究大大提高初筛的工 作效率，也为漆酶基因的功能验证提供了方法【l引。本研究从I4株食 用菌中筛选出～株高产漆酶的真菌，利用不同底物浓度、不同培养时 间、不同培养基对漆酶产生菌株筛选条件进行研究，通过氧化带的产 生、漆酶活性测定筛选出具有高产漆酶的菌株，并通过分子生物学方 一28— 法对菌株的漆酶基因进行克隆，得到一段漆酶基因序列，为今后筛选 漆酶高产菌株及漆酶基因的深入研究提供了理论依据。 1 材料与方法 1．1 供试菌株及培养基 供试菌株由东北农业大学资源与环境学院应用生物科学实验室 提供，试验菌株14株，平菇1500、平菇l0、香菇、猴头、白金针菇、 黄金针菇、榆黄蘑、元蘑、滑菇、鸡腿、黑木耳8808、黑木耳29、 花脸菇、裂褶菌、滑子蘑。 mL 000 Bavendamm氏反应培养基：在lPDA固体培养基中加入 0．4mM鞣酸。 氧化带测定培养基：在PDA固体培养基中加入0．01％、0．04％、 0．06％的愈创木酚。 液体产酶培养基：去皮马铃薯200 g，蔗糖(或葡萄糖)20g。 1．2 试验方法 1．2．1 产漆酶能力试验 将供试菌转接于PDA试管斜面上28℃温箱培养，待菌丝长好转 接到PDA固体平板上，28℃培养8d，用无菌打孔器将平板菌种制成 直径8mm的菌种塞，接种于Bavendamm氏固体平板上进行初筛试 验，观察菌落周围有无褐色轮环产生，有棕褐色轮环者表现为阳性 (+)，反之为阴性(．)。根据所产褐色圈的深度，选出产漆酶能力 强的菌株，记录显色时间。 1．2．2 氧化带测定 将制得的菌塞接种于氧化带测定培养基固体平板中央，28℃条件 21。 下培养，观察氧化带产生情况，记录氧化带颜色【¨，1 1．2．3 酶活力测定 将初筛后的待测菌塞3片，接入装有50mL产酶液体培养基的 250mL三角瓶中，28℃下静置培养，每2d取样测定一次漆酶的酶 31。 活性。酶活测定方法参照【1 2010·7·28—-30中国·昆明 1．3真菌总RNA的提取 将高产漆酶菌接八马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃摇床培养 1 5 0柱式总RNA d，过滤取出菌丝，无菌蒸馏水冲洗，沥水。UNIQ一1 抽提纯化试剂盒提取真菌总RNA。 1．4 RT-PCR ctcttea