基因突变检测方法评价.pdfVIP

基因突变检测方法的评价 黄尚志 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院医学遗传学系 hszAJumc@yahoo．com．cn 人类遗传性疾病数干种，目前能够进行基因诊断的遗传病有2500多种。这些疾 病的致病基因明确，突变也明确。突变类型归纳起来有：单碱基置换、缺失和插入、 conversion)、复杂基因组 重复、倒位、拷贝数变异、动态突变、基因转换(gene 重排、插入．缺失(Indels)、甲基化异常。在DNA水平的改变不外乎碱基数目的变 化和碱基类型的改变。突变发生的部位可以在基因的编码序列、内含子、不翻译区、 调控区，大多改变位于基因的内部或临近的旁侧，有些则遥远的调控区域。 Southem印迹是最早面试的基因检测手段，从多态性(RFLP)连锁分析起步， 最初的直接诊断是针对引起酶切位点改变的突变，其后可以用来直接检测缺失和重 复。基因克隆和DNA序列测定使人们能够更深入了解基因突变的细节，使点突变 的直接检测成为可能。人工合成的寡核苷酸探针(ASO)，可以针对人群中的已知 突变进行检测。当PCR技术诞生之后，PCR产物的酶切代替了Southem印迹杂交 检测检测致病点突变，斑点杂交大大提高了大样本研究的突变检测效率，多重PCR 可以用来检测基因的缺失或某种特定片段的有无。随着时间的推移，不断有新的基 因突变检测方法的诞生，为遗传病的诊断提供了新的手段，同时也在不断更新人们 对遗传病的认识。后来发展的许多检测技术，大都以PCR为基础。 对于这些检测技术的应用，促进了临床遗传病的基因诊断，也促进了产前基因 诊断。在科学研究中，有一种最求，是强调“新、奇、特”，似乎技术越先进越好， 因此才有新技术的涌现。但是有些技术只是“昙花一现”，逐渐被淘汰。在临床应用 中，人们习惯于使用保留技术，不一定追求技术的先进性，而是技术的稳定性、易 操作。面对新技术，需要在实践中体验和验证，做出评价和选择，一般临床实验室 不要急于引入。 Southem印迹杂交已经慢慢地淡出我们的视野，因为它操作繁杂和DNA用量 太多。但它的独到之处是能够检测大片段的改变，例如FMRl基因全突变、面肩肱 型肌营养不良症基因调控区重复序列拷贝数的检测，障碍在于片段较大或序列复杂。 虽然对于FMRl基因的检测已经有了新的检测手段(AmplideX)，但对于面肩肱型 肌营养不良症，现有的其他技术还不能解决。Southern印迹仍然有生命力，只是人 们“不屑”或“顾不上”去做。 PCR扩增具有灵敏性的特点，可以从微量中检测出有，所以污染是一个天敌。 但目前的实验室装备要求中似乎对“污染”有点妖魔化，它混淆了遗传病与感染性 疾病的区别。因为具有灵敏性，有些应用需要谨慎，例如对于FMRl的RT-PCR， 顺着“在脆X综合征中，患者的FMRl基因是全突变，发生了异常甲基化一不转录 一没有mRNA产物”思路，并依据患者的外周血细胞中FMRl蛋白免疫组化检测阴性， 设计了RT-PCT诊断方法。但实验的结果出人意料，患者是FMRlRNA阳性，为什么? 考虑到动态突变的特征，患者是否还存在微量处于前突变的细胞，它们的表达导致 RT—PCR扩增阳性?或者FMRl基因有多个转录本，某些转录本不受FMRl特异启动子 的调控，仍然有转录，需要在引物设计上重新考虑? 131 PCR技术依赖引物的特异性，因此衍生出许多针对已知单碱基改变的PCR方 法，但同时也由于这个特性，模板中与引物3’端部分的碱基改变(primer-SNP)导 致PCR失败，成了一些突变等位基因被漏检的隐患。发生在探针位置的“SNP”也 会引起同样的后果，在依赖杂交结果判断的检测中会出现突变检测不到或某个突变 点纯合的情况；若在以探钊‘杂交为基础的延伸检测技术中，例如MLPA，就可能出 现“缺失”的假象。凡是用引物、探针进行检测的技术都可能因为这些“SNP”导 致误判。 MLPA技术能够同时检测基因序列的缺失和突变，得到人们的青睐，成为一个 炙手可热的方法。它是以探针杂交为依托的，因此便免不了因探针区域的碱基变异 而出现“缺失”的假阳性，例如DMD基因外显子53的