磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C抑制剂D609抑制中华大蟾蜍发育后期尾部程序性死亡.pdfVIP

磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的 抑制剂D609抑制中华大蟾蜍发育后期尾部程序性死亡 张尚立 苗俊英 翟玉梅秦崇涛 黄向炜 国 静 山东大学生命科学学院发育生物学研究所 【作者简介】 张尚立 1992年山东师范大学生物学系本科毕业，山东大学生命科学 学院工程师。主要从事发育过程中细胞分化和程序性细胞死亡方面的研究工作，研 究论文发表在《科学通报》和山东大学学报等刊物上。翟玉梅、苗俊英，山东大学生 命科学学院教授。 【摘要】 为了研究两栖类变态过程中程序性死亡的分子机制，本文利用尾部离体培 养、DNA含量分析、组织切片和形态学分析等方法i观察和分析了中华大蟾蜍变态过 程中尾部程序性死亡的形态学变化；同时研究了磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的抑制 剂对蝌蚪尾部程序性死亡的影响。发现这一特异性抑制剂明显阻止了中华大蟾蜍变 态中尾部的萎缩，表明该酶在其尾部的程序性死亡中发挥重要作用。本文的这一首 次发现为深入研究发育过程中程序性死亡的分子机制奠定了基础。 【关键词】 发育 变态程序性死亡磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c中华大蟾蜍 变态是研究胚胎后期发育的理想模型，特别是两栖类的变态尤为显著，几乎所有的器官都 发生改变。蝌蚪的运动器官一尾部在变态过程中100％发生程序性死亡，引起尾的消失。研 究表明蝌蚪尾部程序性死亡严格受激素控制并与多种酶有关，但是各种酶的作用以及程序性 死亡的信号转导的分子机制尚不清楚。 最近已有充分实验证据表明D609(tricyclodecan…9yl 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C，用这种抑制剂发现该酶参与血管内皮等细胞的凋亡信号转导。 本研究利用这种专一性抑制剂对磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C在中华大蟾蜍蝌蚪尾部程序性 死亡过程中的作用进行了探讨，为深人研究发育后期程序性细胞死亡的分子机制奠定基础。 1材料和方法 I／11TI的尾，放人含青 取发育到36期的中华大蟾蜍蝌蚪，在无菌条件下剪取平均长度为16 salt 霉素和链霉素各100U／ml的赫氏液(Hdtfreter7ssolution)，在23±1￡的条件下培养24h， 然后将培养尾分成两组，每组3条，一组为对照，另一组加入20 t,．g／ml的D609(北京百灵威化 学药品公司)，继续在无菌条件下培养，每2d换一次培养液，每日测量尾长，第7日提取其 DNA并进行含量分析。 ·--——238·-·—— 将处理d7的尾用10％甲醛固定，照相，然后进行石蜡包埋、切片和HE染色。 实验重复3次，每次的每组取3条蝌蚪尾，用t分布进行数据处理和计算P值，以 ‘ P0．05为有明显差异，P0．01为有显著差异。 2结果和讨论 无尾两栖类发育后期的变态过程中尾部的消失是典型的程序性细胞死亡，以发育到36期 的体外培养的中华大蟾蜍蝌蚪尾部(平均长16mm)为实验模型，首先检测了蝌蚪尾部程序性 细胞死亡的代表性的外形变化指标一尾部长度和尾鳍的变化。未经D609处理的蝌蚪尾部在 1TIITI萎缩至平均长度8rain，经D609处理的蝌蚪尾 培养过程中逐渐变短变粗，尾长由平均16 部此变化受到了明显抑制(图1和表1)。为了更清楚地观察尾鳍的变化，将培养至第7目的 尾鳍用10％甲醛固定，固定后的尾鳍部分为白色，对照组的尾鳍消失明显，IM09处理组尾鳍 的这种变化被显著抑制(图2)。以上结果说明D609显著抑制了蝌蚪尾部程序性细胞死亡的 代表性的外形变化一尾部的缩短和尾鳍的变窄及消失。 d后用10％甲醛固定的蝌蚪尾 图l离体培养的蝌蚪尾部的长度变化及 图2离体培养7 其被0609抑制的情况 1一对照组；2—D609处理组