山羊INHβB+cDNA的克隆及序列分析.pdfVIP

中国草食动物科学 2012年专辑 载体、DL20CO、LA TaqDNA、M—MLV逆转录酶、DN目e mRNA全序列设计的引 采用参照牛和绵羊INHBB (Rr·卿“c)、dNTP、琼脂糖、Tfis均购自大连宝生物生物 物，“m羊卵巢组织cDNA为模扳，扩增出一条特异性条 工程有限公司。大肠杆菌DH5a为本实验室保存。其它常 带(圉I)，通过克隆测序发现该片段长为1499 bp。采用 规试剂购自重庆蘸哲科技有限公司。 1．2引物设计与旮成 绵羊(函…)INH[BB外显子I和2及部分CDS 序列(FJl67874)和牛(Bos n～)[NHBB外显子2序列为98％。与牛INHl3B外显子2(U162411)同源性为 (NMl76852)设计m羊INHl3BeDNA序列扩增用引物。 eDNA序列。 9畅．证明扩增片段应为山羊INH]jB 上游引物序列为5-ACCGGCCCACCATGGACGCGC一3J1 下游引物序列为5-ACTCCCTCCACGATCATATT一3’。引 物均南上海生物工程技术服务有限公司合成。 1．3组‰总RNA的提取 取一80℃冰籍中保存的山羊组织。按照Tfiwlj击提取 组织RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸 蛋白仪测定RNA的A2fiO：A280值和RNA浓度，一80％保 存备用。 1．4 ntHl3B克隆 1．41eDNA的合成及PCR扩增取5嶂卵巢组织的 习 Tn^盯： 总RNA，“M—MLV逆转录酶催化合成cDNA’毒照说明 ＆：I 2：PERF#：M：DL2000 书操作。以eDNA为模板，进行FCR扩增，匣应体系为 自i m#INHBBPCRrmF* 2xCCBufferl 12 5“L．dNTP(2．5mM)4lLl。，LA 2．2^羊INI-I口B生物信息学分析 Taq酶 (2,5 u／“L)025止，上、下游引物(10删)各l乩．eDNA (m，)模板2肚，加DEPC水至25“L。反应条件为94℃外显子，外显予i(12-462bP)和外显子2(724—1499bp)， 227 预变性4mln；94℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸 CDSB为I bp，由2个外显子组成。CDS区编码408 60 s，30个循环；72℃延伸5min；4℃蹂存。扩增后用1％个氨基酸．包含20个氨基酸信号肤，380个氨基酸成熟 琼脂糖凝胶电泳检测。 肤。CDS区的碱基中A占1532％、T占1516％、C占 1．42扩增片段的克隆和测序用腔回收试剂盒纯化目 34．64％、G占3488％，G+C古量(6952％)略高于A+T的 的片段，并将其连接到pMDl9-T载体上，转化到大肠杆 菌DHSa菌株中，经蓝白斑筛选，挑选白色单苗落，培养 (亮氯酸)古量较高，分别达到978％和905％，而w(色 后用菌落PER鉴定，挑选插人正确的阳性克隆并抽提质 氪酸)含量最低，帮仅为1．71％。 粒后送至上海英傻生物技术公司测序。 15 n,ral3B的生物信息学分析 点(pI)为494；疏水性最小值为-9567，最大值2267；无 对获得的eDNA