细胞酶联免疫吸附试验在检测噬菌体阳性克隆中的应用和改进.pdfVIP

维普资讯 理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 24()； 二 2 · 1869 · [文章编号] 1000—4718(2008)09—1869—04 · 实验技术 · 细胞酶联免疫吸附试验在检测噬茵体 阳性克隆中的应用和改进 丁 宁 ， 刘承武 ， 李志杰 ， 刘靖华 ， 邓 鹏 ， 姜 勇 (广州市第一人民医院麻醉科，广东广州510180；南方医科大学病理生理学教研室， 广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东 广州510515) [摘 要] 目的：通过对影响细胞ELISA的关键条件和步骤进行优化和改进，以降低实验假阳性率，提高敏 感性。方法：THP一1细胞接种96孔培养板，分别用脂多糖 (LPS)刺激或不刺激作为处理组和对照组 ，将通过噬菌 体展示技术筛选获得的噬菌体分别与处理组及对照组细胞作用，洗脱未结合的噬菌体，加入HRP标记的抗M13单 克隆抗体 ，分别用酶标仪和KodakIS2000R数码成像系统检测细胞与短肽的结合情况。并针对细胞的特性 ，在细 胞的准备、固定、孵育和洗涤等关键步骤进行改进。结果：酶标仪和数码成像系统检测分别得到6个和8个可与细 胞高亲和力结合的阳性噬菌体克隆，经过免疫荧光实验证实数码成像系统检测得到的8个阳性克隆均与细胞结 合，并且数码成像系统多次测量值具有很好的重复性。结论：本方法为蛋白质与完整细胞的亲和活性研究提供了 有效的实验方案，具有较好的应用前景。 [关键词】 细胞；酶联免疫吸附测定；结合亲和力；噬菌体展示 [KEYWORDS] Cells；Enzyme—linkedimmunosorbentassay；Combiningaffinity；Phagedisplay [中图分类号] R392．12 [文献标识码] A 细胞一酶联免疫吸附试验 (enzymelinkedimmunosorbent 1．1 主要仪器和试剂 KodakIS2000R凝胶成像系统 (Ko— assay，ELISA)是用完整细胞代替抗原等可溶性物质包被于 dka)；光学倒置显微镜 (Olympus)；DMRA2正置荧光显微镜 96孔板进行亲和活性检测的一种有效方法，该方法特别适用 (Leica)；二氧化碳孵箱 (Heraeus)；台式高速低温 离心机 于受体表位位于细胞膜上而其特性又不十分清楚或受体难 (Beckman)；倒置 显微镜 (Olympus)；C10台式摇床 (New 于纯化等情况 0J。利用噬菌体肽库对完整细胞进行筛选能 BrunswickScientific)；胎牛血清 (FBS)、RPMI一1640培养基 充分模拟 自然条件下蛋白质分子间的相互作用，有效寻找到 (Gibco)；脂多糖 (1ipopolysaccharide，LPS，血清型Ol11：134)、 特异性结合到细胞系的标志蛋 白和鉴定细胞特异标志，是靶 佛波脂 (Phorbol12一myfistme13一acetate，PMA)、L一谷氨酰 向治疗研究的重要手段，近年来已在血管平滑肌细胞、呼吸 胺 、4一羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes，Sigma)；辣根过氧化物酶标 道上皮细胞 、树突状细胞及各种肿瘤细胞等多种细胞筛选中 记的抗M13单克隆抗体(HRP／Anti—M13)、鼠抗M13单克隆 有成功报道 J。对筛选到的短肽进行亲和活性验证，是降 抗体 (Anti—M13，Pharmacia)；AlexaFluor488标记的羊抗 鼠 低假阳性率 、确保结合特异性和高亲和性的关键步骤。与以 IgG(MolecularProbes)；LumiGLO化学发光试剂 (CellSigna． 蛋白作为 “靶标”的常规ELISA相比．细胞 一ELISA的影响因 1ing)。 素多，如孔间细胞数量的不均一性、洗板时细胞易于脱落、非 1．2 细胞株 人外周血单核细胞 (THP一1)曲本实验室保 特异性结合过多等。本研究在对通过噬菌体展示技术筛选 存，来 自美国组织培养库 (ATCC)。 获得的脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的验证过程中，比