以组织因子为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的合成及其对结直肠癌细胞的影响.pdfVIP

· 420 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012，28(3)：420—426 [文章编号] 1000—4718(2012)03—0420—07 以组织因子为靶点的肿瘤免疫治疗结合物的 合成及其对结直肠癌细胞的影响 许 希 ， 饶本强 ， 梁绮雯 刘 丹 ，谭 获 ， 汪建平地， 黄振倩 (广州医学院第一附属医院肿瘤血液中心，广东 广州 510230；中山大学附属第六医院，广东 广州 510655) [摘 要] 目的：构建含 hFVII—LC+hIgG1一FccDNA的重组真核表达载体 ，并转染中国仓鼠卵巢细胞亚株 CHO—K1获得以组织因子(TF)为靶点的免疫治疗结合物用于肿瘤的靶向治疗。方法：用分子生物学方法从汉族 人肝组织和淋巴细胞中分别获得hFVlI—Lc和hlgG1一FcDNA片段并用连接酶正 向克隆入真核表达质粒pcD— NA3．1(+)中。以脂质体法转染阳性质粒入CHO—K1细胞 ，G418加压筛选获得 阳性单克隆细胞；Excel301无血 清培养液扩大培养，培养液 Ni—NTA亲和层析纯化和制备 hFVIII—LC+hlgG1一Fc融合蛋白，ELISA法检测该融 合蛋白与TF的靶向作用，免疫激活物与结肠癌细胞HT一29及NK细胞混合培养检测结合物激活NK细胞的能力。 结果：以汉族人肝组织和淋巴细胞为模板扩增的hFVII—LC和hlgGl—FcDNA片段经测序证实与基因库报道的系 列完全一致；经酶切分析、测序证实构建的hFVII—LC+hIgG1一Fc融合基因片段完整地落在真核表达质粒pcD． NA3．1(+)的阅读框架中；Lipofcetamine 2000转染试剂能获得含pcDNA3．1(+)一hFVII—LC+hlgG1一Fc阳性 的CHO—K1细胞，经1g／LG418加压筛选可以获得分泌hFVlI—LC+hIgG1一Fc融合蛋白的单克隆细胞株；1LEx— cel301无血清培养液用 Ni—NTA亲和层析纯化可以制备 1．3mghFVII—LC+hIgG1一Fc融合蛋白，经 ELISA法鉴 定与TF具有高亲和力，免疫激活物与结肠癌细胞HT一29及NK细胞混合培养表现出明显的激活NK细胞的能力。 结论 ：成功构建了hFVII—LC+hIgG1一Fc融合蛋白的真核表达载体并获得了分泌hFVII—LC+hIgG1一Fc融合蛋 白的CHO—K1单克隆细胞株 ，为制备以TF为靶点的肿瘤免疫治疗结合物奠定了基础。 [关键词] 肿瘤靶向治疗 ；组织因子 ；免疫结合物 ；CHO—K1细胞 [中图分类号] R363 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．03．007 Constructionofanimmunoconjugatetargetingtissuefactoranditseffect on colorectalcancercells XU Xi，RAO Ben—qiang2， LIANGQi—wen，LIUDan，TANHuo，WANGJian— ping ，HUANG Zhen—qian (T‘umorBloodCenter，FirstAffiliatedHospital，GuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510230，China； Sixth 缸 atedHospital，SunYat—senUnive~ity，Guangzhou510655，China．E—mail：hnangzq2003@yahoo．corn．cn) [ABSTRACT] AIM：ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorPeDNA3．1(+)一hFVII—LC+ hIsG1一Fc．nadtoproduceandpurifytheimmunoconjugatehFVII—LC+hlgG1一Fcprotein．METHODS：Thetarget sequenceswereamplifiedbyRT—PCR from hepatictissuenadlymphocyteRNA，na dclonedin