异丹叶大黄素下调膀胱癌细胞中细胞周期蛋白D1表达的分子机制研究.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2014，30(1)：53-60 · 53 · [文章编号】 1000—4718(2014)01—0053．08 异丹叶大黄素下调膀胱癌细胞中细胞周期蛋白D1 表达的分子机制研究 方 勇 ，王章桂 ，侯 琦 ， 卢 瑜 (浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科，浙江 杭州310016；中国医学科学院协和医科大学药物研究所， 北京 100050；’南京军区杭州疗养院，浙江杭州310007) [摘 要] 目的：探索异丹叶大黄素(1so)下调肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1表达的分子机制。方法：以ISO 作用于人源性膀胱癌UMUC3、RT12和RT4细胞后用 Westernblotting法检测细胞周期蛋白D1表达水平；以RT— PCR法检测细胞周期蛋白D1mRNA的表达水平。稳定转染细胞周期蛋白D1启动子萤光素酶报告基因至UMUC3 细胞并筛选后，检测 ISO预处理后萤光素酶活性。ISO预处理 UMUC3细胞后，提取核蛋白检测核转录因子表达水 平的变化。分别稳定转染 GFP和GFP-细胞周期蛋白D1表达构建载体，筛选克隆；ISO预处理后 ，Westernblotting 法检测细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平，贴壁依赖性细胞生长实验法检测细胞生长能力的变化 ，流式细胞术检 测细胞周期的变化。分别稳定转染人源性细胞周期蛋白D1野生型和一163位点突变型萤光素酶报告基因质粒载 体至UMUC3细胞并筛选，ISO预处理后检测细胞的萤光素酶活性。最后利用染色质免疫沉淀的方法，以抗 Spl抗 体检测 ISO对Spl与细胞周期蛋白D1启动子结合力的影响。结果：ISO可从mRNA和蛋白水平显著抑制肿瘤细 胞的细胞周期蛋白Dl水平 ，并且是从内源性转录水平来抑制细胞周期蛋白Dl的转录。ISO可抑制、下调核转录 因子Spl的表达 ，并抑制Spl与细胞周期蛋白D1启动子区域的结合力，该结合位点主要位于启动子 一92到 +27 bp的5’一非翻译区。结论：ISO可通过下调Spl核转录因子表达及其与细胞周期蛋白D1启动子的结合，从内源性 转录水平来抑制细胞周期蛋白D1的表达，从而诱导Go／G。细胞周期阻滞并抑制肿瘤细胞增殖。我们的研究将为 临床中药单体 ISO综合治疗肿瘤提供新的策略。 [关键词] 异丹叶大黄素；膀胱癌；细胞周期蛋白D1；Spl转录因子；细胞周期阻滞 [中图分类号] R737．1 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000-4718．2014．01．009 Molecular mechanism of down-regulating cyclin D1 expression by isornapontigem n FANGYong，WANGZhang—gui，HOUQi，LUYu (DepartmentofMeScalOncology，SirRunRunShawHospital，ZhejiangUniversitySchoolofMedicine，Hangzhou310016， China；MateriaMedicaInstituteofChineseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionMedicalCollege，Beqing 10(1050， China；HangzhouSanatoriumofNanjingMilitaryRegion，Hangzhou310007，China．E-mail：luyuhzll@sina．corn) [ABSTRACT] AIM：Toexplorethemolecularmechanismofdown-regulatingcyclinD1expressionbyisorhaponti· genin(ISO)．METHODS：TheproteinexpressionofcyclinD1inUMUC3，RTll2andRT4bladdercancercellswasde— terminedbyWeste