新城疫病毒Sd一2株F基因的克隆和序列分析dy0.pdfVIP

试验研 究 7 新城疫病毒 Sddy一02株 F基因的克隆及序列分析 徐 守振① 沈志强② 管 宇② 崔言J顿① (① 山东农业大学动物科技学院 泰安 271018 ②滨州畜牧兽医研究所) 摘要 将 山东省东营地 区分离的新城疫病毒 亡后无菌收取尿囊液 。测定其病毒效价，采用透析 (Sddy一02)，用RT—PCR扩增裂解位 ．、前后的F基 袋浓缩法将病毒浓缩 3O倍 。利用一步法提取基因 因363bp片段 ，同时进 行克隆和序列测定分析 。参 组 RNA。 考 国内外 已发表新城疫各代表株 ，以 363bp绘制 1．5 NDVF基 因的 RT—PCR (1)F基 因 cDNA 了NDV系统发育进化树 ，并分析其遗传关系。结果 的合成：以P 为反转录引物，以NDV基因组 RNA 表 明：Sddy一02株 与 已发表 的NDV 各代表株 的核 为模板 ，按 AMV(Promega)说明书进行。(2)F基 苷酸序列同源性为84 ～98 ；氨基酸序列分析表 因的PCR反应体系 ：PCR扩增按如下顺序加样进 明该株为强毒株 ；进化地位为基 因Ⅶ型。本研究初 行 PCR反应 ，ddH2O 53．5 l；Buffer(10x)10 l、 步揭示 了新城疫 的流行规律 ，为制定控制新城疫方 M gCl2(2．5mM )6 l、dNTP(2．5mM )6 l、Primer 法提供 了有益参考和依据 。 (10Urn)各 2 l、Temp20}tl、Taq酶 0．51}tl，共计 关键词 新城疫 克隆 F基 因 进化树 100 l。混匀后进行下列循环反应 ，98℃10S；55C 新城疫是 由新城疫病毒引起的严重危害养鸡 30S；72’C90S，35Cycles72C‘10min。 业发展的禽病之一。NDV是副粘病毒科、副粘病毒 1．6 F基 因克隆与鉴定 RT—PCR产物用低熔点 属的代表种，为一种有囊膜的单股负链RNA病毒 。 琼脂糖电泳 回收。按照pMD18一TEasyVector试剂 NDV基因组全长约为 15kb，编码 6种结构蛋 白。 盒使用说明书进行克隆和酶切鉴定。 目前诸多研究表 明，NDV 的融合蛋 白(F)和血凝素 1．7 重组质粒的核苷酸序 列测定分析 F基 因阳 一 神经氨酸酶 (HN)是构成其致病性的基础 ，尤其是 性克隆核苷酸序列 由TaKaPa生物公司大连分公 F蛋 白发挥着重要作用。NDVF基 因的遗传变异 司测定 。用 Genedoc软件分析核苷酸序列同源性 。 与 ND的流行密切相关 。本试验在对 NDVSddy一02 1．8 系统发育进化树 的建立 用 DNAStar软件 的F基因核苷酸序列测定的基础上 ，进行 了较为系 包 中MeAlign软件计算遗传距离 (JotunHein法 ， 统 的分析 ，绘制 NDV 系统发育进化树 ，这为我省 Ktuple值为 1)，根据遗传距离绘制系统发育进化 NDV的分子流行病学研究提供参考 。 树 。 1 材料和方法 2 结果与分析 1．1 材料 分离株NDV Sddy一02由山东滨州畜 2．1 F基因的克隆与鉴定 经琼脂糖凝胶 电泳分 牧兽医研究所提供 ；SPF鸡胚 由山东省农科院家禽 析表明 (见图 1)，PCR产物为 363bp片段 ，与所设 研究所 SPF种鸡场提供。 计 引物相符 ，为所需阳性克隆片段 。对所获转化子 1．2 试剂 蛋 白酶K、Taq酶、DL2000、BamHI、 酶切 (见 图 2)、PCR鉴定 (见 图 3)结果表 明为 阳 HindⅢ、Ligase、载体 pMD18一T，均 购 自TaKaRa 性 。 生物公司；AMV购 自Promega公司。 2．2 分离株 F基 因序列及分析结果 经 同源性分 1．3 引物 参照国外 已发表的F基 因序列设计 1 析表明该毒株与其它代表株的同源性 84 ～98 ； 对引物 ，用于扩 增 F基因前段 363bp的片段 由