人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)酶联免疫分析.pdfVIP

人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 检测范围：0.78ng/ml-50ng/ml 最低检测限：0.195ng/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人ECP，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中ECP含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗ECP 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化 的抗ECP 抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化 成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ECP 呈正相关。用酶标仪在450nm波 长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板（Assayplate ）：一块（96孔）。 2. 标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。 3. 样品稀释液（SampleDiluent）：1×20ml/瓶。 4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibodyDiluent）：1×10ml/瓶。 5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidinDiluent）：1×10ml/瓶。 6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 8. 底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液（StopSolution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 1. 标准规格酶标仪 2. 高速离心机 3. 电热恒温培养箱 4. 干净的试管和Eppendof管 5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g 离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放 于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2-8°C1000 g离心15分钟，或将标本放 于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g 离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保 存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内， 检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度 应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/ 搓动以助溶解，其浓度为50ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml， 3.12ng/ml，1.56ng/ml，0.78ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。 如配制25ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的 Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl）， 实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻 混匀，在使用前一小时内配制。 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每 孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶 标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，