志贺菌属中鉴别出产CTXM55型菌株.pdfVIP

·1378· ．临床实验诊断研究· 志贺菌属中鉴别出产CTX．M．55型菌株 祝建军 叶金艳杜玉海卢红梅李桂军 在革兰阴性肠杆菌中，国内有关大肠埃希菌、肺炎克雷 9．0)10 DNA1 伯菌和阴沟肠杆菌B内酰胺酶耐药基因已有较多报道¨引， (wt／v01)，TaqpoiU。总反应体积20山(其中模板液 bp)为： 但志贺菌属产B内酰胺酶耐药基因的报道鲜见哺J。我们对 5“)。PCR扩增热循环参数(PCR产物长度500 s，35 20株志贺菌属进行9种B内酰胺酶基因(TEM、SHV、93℃预变性2min，然后93℃608，55℃60s，72℃60 min， CARB、LAP、GES、PER、VEB、CTX．M．1群、OXA-1群)检测，个循环，最后72℃延伸5min，其余均为：93℃预变性2 经测序和BLASTn比对发现CTX—M-55型，报告如下。然后93℃30s，55℃30s，72℃608。35个循环，最后72℃ 一、材料与方法 延伸5min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照 1．菌株来源：20株志贺菌属(4株为宋内志贺菌，16株分子相当的目的条带为阳性，并摄像保存。耐药基因检测试 为福氏志贺菌)收集自2006年11月至2007年10月间就诊剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗 于嘉兴市妇幼保健院住院及门诊20例腹泻患者的大便标 传技术研究所提供。靶基因引物序列和目的产物长度见表1。 本。患者年龄1—25岁(1—2岁18例)，男10例、女10例。5．阳性基因测序：PCR产物采用煮沸法制备模板，选用 菌株鉴定使用ATB．Expresion细菌鉴定仅、糖发酵(杭州天和 微生物有限公司提供)、志贺菌属诊断血清(兰州生物制品 7。采用直接全自 研究所提供)鉴定到种。菌株鉴定参照《全国临床检验操作 动荧光法，在美国ABI公司3730型仪上进行，测序全过程委 规程》第3版…。菌种保存采取冷冻保存法，即用6mm干 托上海博尚生物技术有限公司协助完成，测序结果在 燥灭菌的滤纸片刮取新鲜分纯细菌的培养物，一20℃保存 GenBank中进行比对。 备用。MH培养基来源于法国生物梅里埃公司。标准菌株 二、结果 为大肠埃希菌ATCC25922。 1．药敏结果：20株志贺菌对12种抗菌药物的敏感性见 2．抗菌药物敏感性试验：采用K．B纸片扩散法，根据美 表型确证阳性的15株。 国抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)2006年版要求 进行敏感性判断，测定12种抗菌药物的敏感性(英国Oxoid2．志贺菌属PCR检测结果：20株志贺菌属中4株为宋 公司提供)。超广谱B内酰胺酶(ESBLs)表型确证试验按 CLSI 2006年版要求进行，2组纸片为：(1)头孢他啶(CAZ)， 头孢他彩克拉维酸(CAZ／CLA)；(2)头孢噻肟钠(CTX)，头 孢噻j彤克拉维酸(CTX／CLA)，35℃培养16—18h，其中任 意～组出现加克拉维酸比不加克拉维酸的药物抑菌环≥ 验阳性产ESBLs志贺菌属中，8株经PCR扩增证实携带 5mm，确定为产ESBLs菌株哺J。 3．细菌处理：挑纯培养菌落置入0．5ml离心管内(内 预置200 h，改 ng／ml蛋白酶K溶液200山)，56℃水浴2 95℃水浴10min，加入Chelex．100 因阳性产物测序，经BIASTn程序分析，其核酸序列与