益气补肾活血方对佐剂关节炎大鼠IL―10和IL―17的影响.docVIP

益气补肾活血方对佐剂关节炎大鼠IL―10和IL―17的影响 　　【摘 要】目的：采用佐剂关节炎大鼠模型，探讨益气补肾活血方治疗类风湿关节炎的作用机制。方法：以雷公藤多苷作对照，通过对大鼠的体质量和关节肿胀指数进行观察，检测益气补肾活血方对白细胞介素-10和白细胞介素-17水平的影响。结果：与模型对照组比较，益气补肾活血方能显著减轻大鼠关节肿胀指数（2.84±0.13和2.54±0.05，P 0.01）；能明显提高佐剂关节炎大鼠细胞因子白细胞介素-10的水平（0.128±0.016和0.336±0.071，P 0.01），同时降低白细胞介素-17的水平（0.625±0.046和0.335±0.059，P 0.01）。结论：白细胞介素-17和白细胞介素-10在类风湿关节炎发病机制中具有重要作用，通过益气补肾活血方治疗可调节其水平。 　　【关键词】 关节炎，类风湿；大鼠关节炎模型；益气补肾活血方；雷公藤多苷；IL-10；IL-17 　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的自身免疫性疾病。我们根据全国名老中医陈湘君教授治疗 RA的经验，筛选益气补肾活血中药对佐剂关节炎大鼠进行早期干预治疗，观察益气补肾活血方对早期RA外周血中细胞因子的影响，以探讨该复方防治RA的作用机制和作用靶点。 　　1 实验材料 　　1.1 实验动物 SD大鼠40只，5周龄，雌性，体质量（150±30）g，SPF级，由西普尔-必凯实验动物有限公司提供，使用许可证：SCXK（沪）2012-0005。 　　1.2 试剂及药物 弗氏完全佐剂（Freunds Adjuvant Complete，FCA），美国Sigma公司产品。白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-17（IL-17）试剂盒，购自上海西唐生物科技有限公司。益气补肾活血方由生黄芪30 g、生白术10 g、白芍30 g、骨碎补15 g、巴戟肉20 g、土鳖虫12 g组成，由上海中医药大学附属普陀医院中药制剂室按既定工艺完成并提供。雷公藤多苷片，黄石飞云制药有限公司产品，生产批 　　2 方 法 　　2.1 动物分组 由上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心负责饲养大鼠，按随机数字表分为空白对照组、模型对照组、雷公藤多苷组和益气补肾活血方组，每组10只。 　　2.2 造模方法 采用常规的佐剂关节炎（AA）大鼠造模方法。于每只大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL 　　弗氏完全佐剂，空白对照组注射生理盐水0.1 mL。 　　2.3 给药方法 造模第14 天开始灌胃给药。空白对照组和模型对照组：按10 mL?kg-1 ig予以生理盐水，每日1次。雷公藤多苷组：将雷公藤多苷片研成细末，用灭菌蒸馏水配制成混悬液（1 mL内含雷公藤多苷0.36 mg），按3.6 mg?kg-1ig，每日1次。益气补肾活血方组：将益气补肾活血方常规煎煮并浓缩生药浓度为480 mg?mL-1，按 　　4 800 mg?kg-1ig，每日1次。每组均给药50 d。 　　2.4 检测指标 　　2.4.1 大鼠体质量 每7～10天称量体质量1次。 　　2.4.2 关节肿胀度 以排水法测量大鼠左右后足体积，于造模后第1，7，14，21，30，40，50天各测量1次。足体积计算方法为：各组所有大鼠左后足体积之和/大鼠数量。 　　2.4.3 细胞因子IL-10和IL-17检测方法 采用双抗体夹心 ABC-ELISA法测定大鼠血清中IL-10和IL-17的水平，严格按照试剂盒说明书要求操作。 　　2.5 实验原理 采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 IL-10 或IL-17单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 IL-10 或IL-17与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-10或IL-17，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450 nm处测OD值，IL-10或IL-17浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-10或 IL-17浓度。 　　2.6 样本收集 ①收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2～8 ℃保存48 h；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。②标准品液配制：使用前加入1 mL蒸馏水混匀，配成20 ng?mL-1的溶液。设标准管8管，第1管加标本稀释液900 μL，第2至第8管加入标本稀释液500 μL。在第1管中加入20 ng?mL-1的标准品溶液100 μL混匀后用加样器吸出500 μL，移至第 　　2管。如此反复做对