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疮疡 化瘀通络中药促进糖尿病皮肤溃疡创面修复的作用机制探讨 阙华发，朱元颖，张臻 (上海中医药大学附属龙华医院， 上海200032) 糖尿病皮肤溃疡，是糖尿病常见的并发症之一，中医药治疗有良好的疗效。我们在长期 的临床实践中，运用化瘀通络中药治疗糖尿病皮肤溃疡取得显著的疗效。为进一步探讨化瘀 通络中药促进糖尿病皮肤溃疡创面修复的作用机制，开展了以下研究。 材料与方法 动物有限责任公司提供。动物合格证号：医动字第02—22—2号。 药物 化瘀通络中药由丹参、桃仁和地龙组成，剂量比例为2．5：1：1，人鼠的剂量为 fibroblast 冰箱保存备用。碱性成纤维细胞生长因子一贝复济(basic growthfactor，bFGF)， 珠海东大生物制药有限公司生产。批号：国药准字 主要实验试剂 免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连接法 (Streptavidin—biotinperoxidase 试剂(HRP／Rabbit)即用型，购于丹麦Dako公司；缺氧诱导因子-1 factot一1 endothelial O【，HIF一10【)、血管内皮生长因子(vascular growth 一抗(兔抗鼠，分别1：1 t anti-F8 00，I：50稀释)，购自美国Santacruz公司；Rabbi IgGl sh (horseradi peroxidase，HRP)标记山羊抗小鼠抗体，购自北京中山公司。 主要实验仪器 IMS细胞图像分析系统，医学图像分析软件，购自上海申藤信息技术有 BH2 数码相机，购自nikon公司。 糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠模型的建立[2～4】给大鼠喂饲高脂饲料(4％胆固醇， 印成糖尿病鼠模型。将大鼠用盐酸氯胺酮(1OOmg／kg)腹腔注射麻醉后，造模区(腰椎正中偏 上)剪毛，用直径15mm的图章标记造模面积，在无菌条件下，沿脊椎方向用外科方法作两条 深达筋膜，直径为1．5cm的创面，造成全层皮肤缺损开放性创面模型。加盖两层消毒干纱布， 用胶布“丰”字形固定。造模后每只大鼠连续4天后腿肌肉注射青霉素40万U。 实验动物分组与给药方法 79只大鼠分2批进行实验。第1批38只大鼠主要用于观察 药物对创面愈合时间的影响。造模前随机设立同龄正常对照组，大鼠8只，其余30只大鼠建 立糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证创面模型。27只成模后再随机分为模型组、化瘀通络组、贝复 剂组，每组9只。第2批41只大鼠主要用于探讨药物促创面愈合的机制。造模前随机设立同 龄正常对照组，大鼠8只；其余33只大鼠成模后再随机分为化瘀通络组、贝复济组、模型对 照组，每组11只。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1／5000呋喃西林溶液清洁创面。 正常对照组及模型对照组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃，每日1次；化瘀通络组外 敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，每日1次；贝复济组外敷以贝复济浸透纱布，按创面大小 剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定，生理 18 盐水灌胃，每日1次。连续用药7d，停药后次日，分别将动物麻醉(氯胺酮)处死，取局部 创面新生肉芽组织为所需实验样品。 创面愈合时间的观察：观察大鼠从创面用药起到创面完全上皮化所需时间； 刨面肉芽组织HIF-t0【、VEGF及MVC、MVA的检测 1．8．1免疫组化s—P法取各组大鼠创面新生肉芽组织，生理盐水清洗后，1O％甲醛溶液 固定。每组随机选取8个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水，浸蜡，包埋，连 室温20min，PBS洗涤，3min×3次；将切片浸入O．Olmol／LpO6．0柠檬酸盐缓冲液中，微 闭内源性非特异性抗原，室温30rain；滴加一抗(分别为上述抗体及相应抗体