青蒿琥酯对人急性白血病原代细胞线粒体膜电位的影响.pdfVIP

全国中西医结合血液学学术会议 1．2磷酸盐缓冲液(PBS)粉：北京鼎国生物技术有限公司产品。 1．3人淋巴细胞分离液：中国医学科学院生物工程医学研究所产品。 1．4小牛血清：杭州四季青生物制品公司产品，临用前56℃水浴30分钟灭活处理后分装， 一20℃保存。 1．5线粒体膜电位检测试剂盒(JC．1)：碧云天生物技术研究所产品。 1．6青蒿琥酯：桂林南药股份有限公司产品(LA090902)，规格：60mg／支。 1．7柔红霉素：浙江海正药业股份有限公司产品(080401B)，规格：20mg／支。 2药物配制 2．1青蒿琥酯 无菌条件下，取青蒿琥酯粉剂60mg，加入所附的5％碳酸氢钠注射液0．6ml，振摇2 分钟，待完全溶解后，注入1640培养液充分混匀，使得溶液体积为6ml。取出lml上述 2．2柔红霉素 无菌条件下，取柔红霉素粉针剂20mg，以1640培养液充分溶解混匀，使得溶液体积 3研究方法 3．1急性白血病原代细胞的获取与培养 无菌操作下取初治或复发急性白血病患者骨髓液4--一5ml，加入抗凝离心管(含肝素 燥离心管中，再缓慢将骨髓液加入分离液上层，离心；取中间呈白膜状的单个核细胞层， 3．2药物处理 化疗药物近似血药浓度按公式计算 最大血药浓度=药物用量／(患者体重x0．08x1000) 以体重60Kg为标准，临床一次使用青蒿琥酯的剂量为120rag，故最大近似浓度为 2509／rrd。体外药物敏感试验选择培养体系药物的终浓度同最大近似血药浓度。 3．3取对数生长期的细胞用于实验，细胞的终浓度为1×106仙。分为5组： (1)高剂量组：青蒿琥酯终浓度为501ag／ml (2)中剂量组：青蒿琥酯终浓度为251ag／ml 493 全国中西医结合血液学学术会议 (3)低剂量组：青蒿琥酯终浓度为12．5I．,edml (4)空白对照组：青蒿琥酯终浓度为oog／IIll (5)柔红霉素对照组：柔红霉素终浓度为12．5rtg／ml 观察组将各浓度青蒿琥酯2m1分别与对数生长期人白血病原代细胞2IIll加入6孔平板培 养板中，使细胞浓度为lxl06／ml。空白对照组加入等体积1640培养液，柔红霉素对照组加 入等体积柔红霉素。将培养板置于混匀器上振荡混匀，然后置于37C、饱和湿度95％、含 5％C02的培养箱中作用48h。 5．激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化 ①原理：线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC．1可以检测细胞、 组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC．1聚集在线粒体的基质中，形成 聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC．1不能聚集在线粒体的基质中， 此时JC．1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测 线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。检测时激发 光设置为525nm，发射光设置为590nm。 ②方法：将经JC．1标记的细胞制成玻片标本后，置于激光共聚焦显微镜的载物台上， 进行扫描、拍照，记录各组细胞内的红绿荧光比例，然后进行数据分析和处理。 4统计方法 实验数据用；±s表示，使用SPSSl7．0统计软件，采用单因素方差分析及组间比较t检验。 5结果 本研究选取广州中医药大学第一附属医院血液科病房确诊为急性白血病的初治或复 发患者10例，抽取患者骨髓进行原代细胞培养，但由于在骨髓原代细胞培养过程中，出 现细胞污染、生长迟缓等原因致细胞死亡或数量不足，不能继续进行实验，因此最终纳入 实验的病例为4例。本研究将药物作用后的细胞经荧光探针JC．1标记后，每组制片5张， 置于激光共聚焦显微镜下进行扫描，每张片计数200个细胞，每组共计1000个细胞，记 录不同组别的红绿细胞数量比，以红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。红色 荧光代表线粒体膜电位较高，绿色荧光代表线粒体膜电位较低，绿荧光越多代表凋亡的细 胞数量越多，反之凋亡的细胞数量越少。如彩图所示： 494 全国中自Ⅸ站台血液学学术台议 ]．1L l一]彩图8