松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

第 26卷 第 1期 青 岛大 学 学报 (工 程 技 术 版 ) VoI_26NO．1 2011年 3月 JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY (ET) M ar．20 1 1 文章编号：1006 9798(2011)01—0059—07 松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 任慧杰 ，郭道森 ，赵博光 ，李荣贵 (1．青岛大学生物 系，山东 青 岛266071；2．南京林业大学森林资源与环境学院，南京 210037) 摘要 ：采用 PCR技术克降了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46，克隆基因与已报道的 纤维素酶基 大【jBXC10(GenBank 录号 ：FJ598020．1)的同源性高达 99％，将其克隆到表 达载体 pET 15b上构建 了表达载体 pET一15b BXC。将 该重组质粒转 化大肠杆菌 BI2l(DE3)菌株构建T程菌 ，SDS—PAGE分析表 明，IPTG诱导 了纤维素酶在工程菌 中 表达 。采用 N NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶 ，DNS法进行 的活性测定表明．部分纯化的重组蛋 自具有纤维素酶的活性 ，其最适温度为 45℃，最适 pH为 4．()。 关键词 ：松材线虫 ；纤维素酶；基 大[J克隆 ；表达 中图分类号 ：Q936 文献标识码 ：A 松萎蔫病 (pinewiltdisease)是 由松材线虫 (Bursapkelenchus．rylopkilus)引起的一种毁灭性植物病害， 该病 于 1905年在 日本长崎被首次发现．目前 已成为世界范围内的严重森林病害 。许多研究 。证实了 纤维素酶在松萎蔫病的病理进程中发挥一定的作用。()dani等 早前研究松材线虫的致病机理时曾发现松 材线虫可 以分解羧 甲基纤维素．用市售纤维素酶浸泡松苗 ，出现类似松萎蔫病 的枯萎症状 ，由此推测松材线 虫可 以分泌纤维素酶降解松树细胞壁中的纤维素。Kojima等j 曾对松材线虫 的分泌物进行 了电泳分析 ，发 现松材线虫分泌的纤维素酶与拟松材线虫的酶谱存在着差异 ，而且松材线虫分泌的纤维素酶还具有分解结 品纤维素的能力。蒋丽雅等 也 曾对松材线虫虫体提取液和分泌液中的纤维素酶进行了定性分析，结果表 明，所检测的松材线虫均含有纤维素酶 ，而拟松材线虫几乎没有 纤维素酶。本研究根据 纤维素酶基 因 BXC10设汁了--x~引物，以松材线虫的 cI)NA文库 为模版 ，利用 PCR技术 ，扩增出了纤维素酶 的编码基因， 将其克降到表达载体上 ，在大肠杆菌中成功表达 r重组蛋 白，并研究了部分纯化的纤维素酶的理化性质 ，以 期为深人了解纤维素酶住松萎蔫病 中的作用提供理论基础 。 l 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 松材线虫 松材线虫 (13ursapkCZecH(，2“ryZopkilus)南南京林业大学资源与环境学院提供 ；无菌松材线虫的获得参 照林峰 ]的方法 。 1．1．2 菌株与质粒 E．coliDHSa和 E．coliB121(DE3)购 自美同 Novagen公司，质粒 pET 15b—crtB 由本实验室构建并 保存 。 1．1．3 主要试剂 收稿 日期 ：20】0 10—1l 基金项 目：同家 自然科学基金资助项 目(3lO74256)；山东省 自然科学基金资助项 目(2010ZRE01037) 作者简介：任慧杰 (1986 )，女 ，山东泰安人 ，硕士研究生 ，研究方向为植物病原微生物的检测与控 制。 通讯作者 ：李荣贵 ，教授 ，博导 Email：rongguili@yahoo．corn 6O 青 岛大 学 学报 (工 程 技 术 版 ) 第 26卷 限制性内切酶 NdeI和 XhoI，T4DNA连接酶 ，TaqDNA聚合酶，pMD18一T载体 ，质粒提取试剂 盒，胶回收试剂盒，蛋 白预染 Marker购 自TaKaRa公司；IPTG(异丙基硫代一8一D一半乳糖苷)，咪唑为Sig— ma公司产品；Ni一NTA层析柱为美国Invitrogen公司产品